Modellierung von Cytochrom P450-Monooxygenasen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Modelle zur Vorhersage der Selektivität und Aktivität von P450-Monooxygenasen und dem Einfluss von Mutationen auf diese entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich auf zwei P450-Monooxygenase-Systeme, die bakterielle P450-Monooxygenase P450 BM-3 (CYP102A1) und die humanen P450-Enzyme des xenobiotischen Metabolismus. Cytochrom P450 BM-3 ist ein interessantes Enzym für biotechnologische Anwendungen. Aufgrund der Fähigkeit zur selektiven Oxidation von chemischen Verbindungen ermöglicht P450 BM-3 interessante Anwendungen in der Enzymkatalyse im Bereich der "weißen Biotechnologie". Darüber hinaus gewinnt P450 BM-3 als Modellsystem für humane P450-Monooxygenasen im Bereich der "roten Biotechnologie" zunehmend an Bedeutung. Das Verständnis von Aktivität und Selektivität von P450-Monooxygenasen auf molekularer Ebene ist eine wichtige Voraussetzung für das rationale Proteindesign und die Verbesserung der Enzyme in Hinblick auf Aktivität, Spezifität und Selektivität. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch molekulardynamische Simulationen die Aktivität, Regio- und Stereoselektivität von Hydroxylierungsreaktionen vorhergesagt werden kann. Humane P450-Monooxygenasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus von Arzneimitteln und anderen Xenobiotika. Der Metabolismus ist ein zentraler Schritt für den Abbau bzw. die Aktivierung von Wirkstoffen. Die Vorhersage des bei Reaktion mit einem bestimmten Isoenzym zu erwartenden Metaboliten ist eine große Hilfe für die Wirkstoffentwicklung. Für die beiden bedeutendsten humanen P450-Enzyme CYP3A4 und CYP2D6 konnte ein einfaches, generelles und prädiktives Modell der Regioselektivität erstellt und erfolgreich an einem Datensatz aus Literaturdaten validiert werden. Polymorphismen in den Genen der humanen Cytochrom P450-Monooxygenasen haben einen bedeutenden Einfluss auf den Metabolismus von Arzneimitteln. Es ist eine große Anzahl von Allelen bekannt aber für viele Allele ist keine Information über den Einfluss auf die Enzymaktivität verfügbar. Aufgrund der Bedeutung möglicher funktioneller Effekte der Allele für den Arzneimittelmetabolismus besteht ein großes Interesse an der Vorhersage des Einflusses von Polymorphismen auf die Enzymaktivität. In der vorliegenden Arbeit konnte ein Modell entwickelt werden, das anhand einfacher Regeln erlaubt den Effekt von Mutationen auf die Enzymaktivität vorherzusagen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es durch die Analyse von Sequenz-Struktur-Funktion-Beziehungen möglich ist, die molekularen Grundlagen der Effekte von Mutationen auf die Enzymaktivität zu verstehen.

Within this work computational models have been developed for the prediction of the selectivity and activity of cytochrome P450 monooxygenases and the influence of mutations on them. This work focuses on two P450 monooxygenase systems: The bacterial P450 monooxygenase P450 BM-3 (CYP102A1) and the human P450 enzymes, the latter participating in the xenobiotic drug metabolism. Cytochrome P450 BM-3 is an interesting enzyme for biotechnological applications. Due to the possibility of the selective oxidation of chemical compounds, P450 BM-3 facilitates attractive applications in enzyme catalysis in industrial biotechnology. Furthermore, P450 BM-3 gains in importance as a model system for human P450 monooxygenases in the field of "red biotechnology". The understanding of activity and selectivity of P450 monooxygenases on a molecular level is an important requirement for rational protein engineering and for the improvement of the enzymes with regard to activity, specificity, and selectivity. In the present thesis it was shown, that molecular dynamics simulation can be applied for the prediction of the activity, regio-, and stereoselectivity of P450 reactions.Human P450 monooxygenases play an important role in the metabolism of drugs and other xenobiotics. The prediction of the site of metabolism is of considerable interest especially for drug development in the pharmaceutical industry. For the both most important human drug metabolising enzymes CYP3A4 and CYP2D6 a simple, general, and predictive model of the regioselectivity could be developed and validated using a substrate dataset from literature.Polymorphisms in genes, coding for human P450 monooxygenases, have a significant influence on the drug metabolism. There is a multiplicity of SNPs known. Nevertheless, for the better part of these alleles no information about the influence of the mutants on enzyme activity is known. Due to the relevance of potential functional effects of the variants on the drug metabolism, there is great interest in the prediction of the effect of these mutations on enzyme activity. Within this work a model with simple rules was developed, which allows the prediction of the effect of SNPs on enzyme activity. Additionally it was shown, that sequence-structure-function-analysis facilitates a understanding of the molecular basis of mutant effects.