DNA microarray based gene expression profiling in human hepatocyte cells to serve as a basis for dynamic modelling of the human liver : a systems biology approach

Abstract

This thesis provides a holistic overview over the gene expression pattern in human hepatocyte cells after induction with rifampicin. The expression levels of all human genes were determined using full genome microarrays from Affymetrix after several points in time (6, 24 and 72 h) after induction in three individual patients. In addition 151 liver specific genes were monitored more frequently using sub-genome Arrays from Eppendorf. The results were confirmed by Realtime PCR and Western-Blot analysis. Identified genes play a role in carbon metabolism (gluconeogenesis), in heme biosynthesis, in bulirubin-, bile acid- and lipid metabolism as well as xenobiotic-metabolism and transport. The observed cell response on RNA level over time allowed new insights in the regulation of this complex system. Next to the network reconstruction, based on the full genome array data, the highly time resolved measurements enable dynamic modelling of expression and therefore a mathematical reproduction of the cellular response upon the stimulus. Using the developed models predictions concerning the behaviour of the "system hepatocyte" and the associated regulations will be possible in the future. This model based prognosis will especially allow improved drug development and personalized medicine.

Die hier vorgestellte Arbeit bietet erstmalig einen ganzheitlichen Ansatz zur Untersuchung der zeitaufgelösten Genexpression in humanen Leberzellkulturen nach einem Stimulus mit Rifampicin. Die Daten aus der das gesamte menschliche Genom umfassenden Analyse mittels Desoxyribonukleinsäure-Microarrays (DNS-Microarrays) wurden durch zusätzliche auf Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) basierende Experimente mit einer Auswahl an Genen ergänzt und verfeinert. Ein weiteres Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand im Vergleich geeigneter analytischer Verfahren zur Messung der transkriptionellen Veränderung in primären Leberzellkulturen und deren Etablierung. Getestet wurden drei Plattformen der Firmen Affymetrix, Agilent und Eppendorf in Bezug auf Leistungsumfang, Handhabung, Preis, Reproduzierbarkeit und Qualität der Ergebnisse. Die etablierten Methoden wurden, wie Eingangs skizziert, zur spezifischen Analyse der Regulation von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) auf Transkriptebene sowie zur globalen Untersuchung der Veränderung der Gen Expression des Transkriptoms herangezogen. Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressionsstudien konnten zahlreiche Ergebnisse wissenschaftlicher Arbeiten ergänzt und bestätigt werden. Der Vergleich dreier kommerziell erhältlicher Microarray-Plattformen zeigte, dass die Daten der untersuchten Plattformen vergleichbar reproduzierbare Ergebnisse liefern. Es wurde eine Korrelation von 0,62 zwischen den Daten der Affymetrix- und Agilent Chips sowie eine Korrelation von 0,63 zwischen den Resultaten, die mit Affymetrix und mit Eppendorf Chips erhoben wurden, gefunden. Zudem wurde gezeigt, dass die Interplattform Variabilität für Affymetrix Arrays bei 0,93 und bei Eppendorf Chips bei 0,8 lag. Des Weiteren wurde eine Vielzahl an signifikant differenziell exprimierten Genen, reproduzierbar sowohl mit der Affymetrix als auch der Eppendorf Plattform, nach Induktion durch Rifampicin identifiziert. Diese haben unter anderem Aufgaben im Energiestoffwechsel (Gluconeogenese), in der Häm-Synthese, im Bilirubinstoffwechsel, im Gallensäurestoffwechsel, im Lipidstoffwechsel und nicht zuletzt im Fremdstoffwechsel und Transport. Die Beobachtung der Antwort der Zellen auf RNS Ebene über die Zeit erlaubte zudem in Kooperation mit dem Institut für Bioverfahrenstechnik neue Einblicke in die Regulation dieses komplexen Geschehens. Neben der Netzwerkrekonstruktion, basierend auf den das gesamte Genom umfassenden Array Daten, ermöglichen die mit einer höheren zeitlichen Auflösung vorliegenden Daten eine dynamische Modellierung der Expression und damit eine mathematische Abbildung der Antwort der Zelle auf den Stimulus. Basierend darauf sollen in Zukunft auch prädiktive Aussagen über das Verhalten des "System Hepatozyt" möglich sein. DNA Chip basierte Pharmakogenomik und Toxikogenomik wurden kürzlich sowohl durch die "US Food and Drug Administration" (FDA) als auch die "US Environmental Protection Agency" (EPA) als Schlüssel zur Entwicklung personalisierter Medizin identifiziert. Die auf "omics" Daten basierenden, modellgestützten Vorhersagen werden neben der personalisierten Medizin (Diagnose und Therapie) insbesondere auch eine Verbesserung der Medikamentenentwicklung und Risikoabschätzung mit sich bringen.