Untersuchungen zur selektiven enzymatischen Hydroxylierung von Fettsäuren

Abstract

Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der enzymatischen Oxidation von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen. Dabei stand die Hydroxylierung von gesättigten Fettsäuren bzw. die Veränderung der Hydroxylierungsposition im Vordergrund. Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP) können molekularen Sauerstoff unter Aufnahme von zwei Elektronen aktivieren, wodurch ein Sauerstoffatom auf ein Substrat-Molekül übertragen wird, das andere Sauerstoffatom tritt bei der Reaktion in Form von Wasser aus. Die Elektronen für die Katalyse stammen von Cofaktoren (meist NADH oder NADPH) und werden mittels Elektronentransferproteinen auf das Hämeisen von P450 Monooxygenasen übertragen. Im Gegensatz zu den meisten anderen P450-Enzymen sind die Enzyme der Subfamilien CYP102A und CYP152A nicht von Redoxproteinen abhängig. Bei CYP102A-Enzymen handelt es sich um Fusionsproteine, die aus einer Monooxygenase- und einer FAD/FMN-enthaltenden Reduktasedomäne bestehen. Die Elektronen werden vom Cofaktor NADPH auf die Reduktase übertragen. Der schnelle Elektronentransfer im CYP102A-System führt bei der Umsetzung mit natürlichen Substraten (mittel- und langkettige Fettsäuren) zu den höchsten für P450 Monooxygenasen gemessenen Umsatzraten (>1000 min-1). Bei CYP152A1 handelt es sich genau genommen um eine Peroxygenase, die Wasserstoffperoxid als Elektronen- und Sauerstoffquelle nutzt. Mit langsameren Raten ist jedoch auch eine Katalyse mit molekularem Sauerstoff unter Verwendung von Elektronentransferproteinen möglich. Die CYP102A-Enzyme und CYP152A1 unterscheiden sich in der Regioselektivität der katalysierten Hydroxylierung. Während CYP102A-Enzyme Fettsäuren in subterminalen Positionen (omega-1 bis omega-3) hydroxylieren, erfolgt durch CYP152A1 die Hydroxylierung in alpha- und beta-Position. Die Verschiebung der Hydroxylierung der Capryl-, Caprin- und Laurinsäure nach gamma- und delta-Position würde in Hydroxysäuren resultieren, die direkte Vorläufer von Lactonen darstellen. Lactone sind interessante Geruchs- und Aromastoffe mit fruchtigem Charakter (Pfirsich, Kokosnuss). Für CYP152A1 wurden mit Hilfe des rationalen Protein-Designs verschiedene Mutanten erstellt, die eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Fettsäurebindestelle enthalten. Allerdings erwies sich nur der CYP152A1-Wildtyp als aktiv. Die erstellten Mutanten ließen sich zum Teil exprimieren, waren jedoch für die Umsetzung von Fettsäuren nicht produktiv. CYP102A7 ließ sich erfolgreich exprimieren und konnte in dieser Arbeit charakterisiert werden. CYP102A7 hydroxyliert Fettsäuren hauptsächlich in omega-2-Position, daneben werden noch omega-1- und omega-3-Position hydroxyliert. Daher ist CYP102A7 nicht für die Entwicklung einer gamma- oder delta-Hydroxylase prädestiniert. In Gegenwart des polaren Lösungsvermittlers DMSO zeigt CYP102A7 hohe Aktivität. Die Stabilität gegenüber Lösungsvermittlern ist besonders interessant für die Entwicklung von Prozessen mit hydrophoben Substraten. Neben Fettsäuren akzeptiert CYP102A7 auch Terpenoide als Substrate. Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen an CYP102A1 (P450 BM3) durchgeführt. Verschiedene Kristallstrukturen (mit und ohne Substrat komplexiert) machen das Enzym zugänglich für Methoden des rationalen Protein-Designs. Um die Regioselektivität der Fettsäurehydroxylierung von omega-1- bis omega-3-Position in Richtung gamma- und delta-Position zu verschieben, wurden Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Protein-Designs angewendet. Mit Hilfe eines in der Arbeit entwickelten Assays, mit dem über 6000 Mutanten analysiert wurden, war es nicht möglich eine wesentliche Verschiebung im Vergleich zum Ausgangsenzym zu erhalten. Allerdings wurden durch rationales Protein-Design Positionen identifiziert, die für eine zielgerichtete Veränderung des Produktmusters vorteilhaft sind. Mit der Mutante S72Y V78A F87A wurden, gemessen am Gesamtprodukt, 16% delta-, 5% gamma- und 9% beta-Hydroxylaurinsäure erzeugt.

The aim of this work was the investigation of the enzymatic oxidation of fatty acids for the production of commercially interesting compounds e. g. hydroxy fatty acids for lactone synthesis. As target enzymes Cytochrome P450 monooxygenases were investigated. Cytochrome P450 monooxygenases are highly versatile biocatalysts. They are able to carry out different oxidation reactions like the epoxidation and hydroxylation of aliphatic and aromatic hydrocarbons as well as dealkylation reactions. Their ability to insert oxygen into non-activated C-H-bonds is one of the potentially most useful catalytic reactions which cannot be addressed chemically, yet. Nevertheless, P450-catalysed reactions on an industrial scale have so far only been implemented in whole cell biotransformations. P450 monooxygenases activate molecular oxygen. In the course of the reaction a two-electron reduction of the active site heme iron occurs. One oxygen atom is inserted into a substrate and the second oxygen atom is reduced to water. Electrons employed in catalysis are delivered from cofactors (usually NAD(P)H) and are transferred to the active site heme iron via electron transfer proteins. The use of CYP102A enzymes simplifies the P450 system, because these enzymes are fusion enzymes consisting of a monooxygenase and a FAD/FMN containing reductase domain in one polypeptide chain. The very efficient electron transfer in CYP102A enzymes leads to the highest turnover numbers measured for P450s so far (>1000 min-1). CYP152A1 was investigated in the thesis as well. It is a peroxygenase utilising hydrogen peroxide as an electron and oxygen source. This simplifies the P450 system compared to CYP102A enzymes since there is no need for the expensive cofactor NADPH. CYP102A enzymes and CYP152A1 differ in regioselectivity of fatty acid hydroxylation. CYP152A1 catalyses hydroxylation mainly in beta-position while CYP102A enzymes catalyse hydroxylation of fatty acids in subterminal positions (i. e. omega-1 to omega-3). A change of the hydroxylation positions to gamma- and delta-position leads to hydroxy fatty acids that are direct precursors for lactone synthesis. Lactones are flavours and fragrances having a fruity note (peach, coconut). In the case of CYP152A1 different mutants were created which contained an altered fatty acid binding site. However, only the wild type enzyme showed activity. CYP102A7 was expressed actively and characterised in this work. CYP102A7 hydroxylated fatty acids mainly at omega-2-position. omega-1-and omega-3-positions are hydroxylated in minor amounts. Therefore CYP102A7 was not suitable for evolving a gamma-/delta-hydroxylase. However CYP102A7 has some biotechnological potential for other reasons. In the presence of DMSO CYP102A7 shows high activity which is favourable to the implementation of processes using hydrophobic substrates. Besides fatty acids CYP102A7 also accepts terpenoids (e. g. limonene, geranylacetone and nerylacetone). In contrast to CYP102A7 different crystal structures of CYP102A1 are available, which makes a rational protein design feasible. To change regioselectivity of fatty acid hydroxylation from omega-1- and omega-3- to gamma- and delta-position, methods of directed evolution and protein design were applied. After the development of a regiospecific hydroxylation assay over 6000 mutants of a CYP102A1 enzyme library were screened but no substantial change in regioselectivity was achieved. Using rational protein design different positions in CYP102A1 were identified which proved to be beneficial to a desired change in regioselectivity. Hydroxylation of lauric acid with CYP102A1 mutant S72Y V78A F87A resulted in 16% delta-, 5% gamma- and 9% beta-hydroxy lauric acid.