Massenspektrometrische Diagnostik von CYP2B6 Polymorphismen : phänotypische Ausprägung in Lebergewebe und klinische Bedeutung

Abstract

Für Fremdstoff- und Arzneimittelstoffwechsel sind hauptsächlich die Cytochrom P450 (CYP) Enzyme der Leber verantwortlich. Diese Superfamilie der Monooxygenasen ist fähig, Arzneimittel und andere potentiell toxische Fremdstoffe in hydrophilere und damit leichter eliminierbare Stoffwechselprodukte umzuwandeln. Das CYP Isoenzym CYP2B6, das im Zentrum dieser Arbeit steht, metabolisiert verschiedene klinisch verwendete Medikamente wie Cyclophosphamid (ein Zytostatikum), Bupropion (Raucherentwöhnungstherapie) oder den reversen Transkriptase Hemmer Efavirenz (HIV-Therapie). Expression und Aktivität dieses Enzyms sind interindividuell hochvariabel, was neben biologischen und Umwelt-Faktoren auch genetische Ursachen hat. Zu Beginn dieser Arbeit waren Ausmaß und Auswirkungen von „single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) bislang nur unzureichend untersucht. Dies lag hauptsächlich daran, dass ein geeignetes analytisches Verfahren für die Detektion der immer größeren Zahl von neu entdeckten Varianten und deren phänotypische Korrelation fehlte. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist ein effizientes und sensitives Hochdurchsatz-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion mehrerer SNPs. Der Vorteil gegenüber anderen Verfahren beruht auf der simultanen Genotypisierung mit Hilfe allel-spezifischer Primer-Verlängerungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf dieser Basis eine hocheffiziente Genotypisierungsmethode entwickelt, validiert und etabliert. Die Methode ermöglichte es, für große Probenzahlen viele Mutationen (n=19) des CYP2B6 Gens in kurzer Zeit und mit großer Präzision zu detektieren, wie an einem ausführlichen Vergleichstest nachgewiesen wurde. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Untersuchung der möglichen klinischen Relevanz einzelner CYP2B6 Polymorphismen und Allele durch veränderte Proteinexpression bzw. -aktivität, unter Berücksichtigung von nicht-genetischen Faktoren wie Geschlecht, Alter, Rauchverhalten, Kaffee- bzw. Grapefruitsaftgenuss und Medikation. Dies konnte anhand einer umfangreichen Leberbank (n=235) durchgeführt werden. Die Ergebnisse liefern erstmals deutliche Hinweise auf die Assoziation einiger Allele, hier sei das CYP2B6*6 Allel hervorgehoben, mit einem niedrigen Protein-Gehalt und einer erniedrigten Enzymaktivität. Eine signifikante Beeinflussung der Proteinexpression oder der Enzymaktivität durch das Geschlecht, das Alter oder die Umweltfaktoren konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Allerdings wurde ein Induktionseffekt der CYP2B6 Expression bei Patienten beobachtet, die mit dem Antiepileptikum Carbamazepin oder dem Analgetikum Metamizol behandelt wurden. Verschiedene Kooperationen zu klinischen Gruppen ermöglichten die Untersuchung von Polymorphismen des CYP2B6 an Patientenkollektiven mit differentem Krankheitshintergrund. CYP2B6 und Morbus Parkinson: Neurologisch wirksame Substanzen wie Selegilin (Parkinson-Therapie) und andere exogene Umweltstoffe (Nikotin) werden von CYP2B6 metabolisiert. Das Protein ist zudem auch im Gehirn exprimiert. Eine mögliche Assoziation von CYP2B6 mit der Parkinsonschen Krankheit wurde mit Hilfe der Genotypisierung der CYP2B6 Polymorphismen an DNA-Proben einer „case-control“ Studie mit Parkinson Patienten untersucht, in der Polymorphismen in anderen Stoffwechsel-Enzymen als mögliche Risiko-Faktoren beschrieben wurden. Diese Analyse ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied der Frequenz der CYP2B6 Genotypen zwischen Patienten und Kontrollgruppe. Dass CYP2B6 für die Entstehung von Morbus Parkinson eine Rolle spielt, kann damit jedoch nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden. Denn möglicherweise wirkt sich der Polymorphismus nur in Zusammenhang mit bestimmten Noxen aus. Dies könnte in spezifischen Studien weiter untersucht werden. CYP2B6 und HIV-Therapie: Neue und seltene CYP2B6 Mutationen waren hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung in der HIV-Therapie noch weitestgehend unbekannt. Die Ergebnisse der Genotypisierung von DNA-Proben verschiedener HIV-Populationen belegten eindrucksvoll die Assoziation der CYP2B6 Variante *6 sowohl mit erniedrigter Proteinexpression und Efavirenz-Hydroxylierung in vitro als auch im klinischen Umfeld der Efavirenz-Therapie. Zum ersten Mal wurde hier eine umfassende Analyse durchgeführt, die neben dem *6-Allel auch seltenere „loss-of-function“ Allele mit einschloss. Dadurch konnte die Prädiktivität für unerwartet hohe Plasmaspiegel des HIV-Therapeutikums erheblich gesteigert werden. Die technischen Entwicklungen und Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit können zukünftig helfen, die Arzneimitteltherapie mit CYP2B6 Substraten zu optimieren. Sie unterstreichen den Wert der umfassenden prädiktiven CYP2B6 Genotypisierung für eine Anpassung der Medikamentendosis, um Nebenwirkungen zu vermeiden und das Ansprechen zu verbessern.

Cytochrome P450 (CYP) enzymes of the liver are the most important enzymes in drug metabolism. This superfamily of monooxygenases is able to transform drugs and possible toxic xenobiotics into more hydrophilic products easier to eliminate. The CYP isoenzyme CYP2B6 as focus of this thesis metabolizes drugs like cyclophosphamide (cytostatic drug), Bupropion (smoking cessation) or the reverse transcriptase inhibitor Efavirenz used against HIV. The interindividual expression as well as the activity of this enzyme is highly variable, caused either by biological or environmental or genetic factors. The extent and mechanisms behind “single nucleotide polymorphisms” (SNPs) are not yet fully analyzed. This fact was mainly due to a missing suitable analytical technique for the detection of the rising new variants and their correlation to the phenotypes. MALDI-TOF mass spectrometry is a highly efficient, sensitive high-throughput technique for the simultaneous detection of several SNPs. One advantage of this method compared to other detection methods is that of allele-specific primer extensions. In this work, a highly efficient genotyping method was developed, validated and established, which can be used to detect a lot of mutations (n=19) in the CYP2B6 gene for large study populations very precisely and in a real short time, as it is shown in this comprehensive and comparative analysis. The second part of this work concentrated on the analysis of the clinical relevance of several CYP2B6 polymorphisms/alleles on protein expression and activity in relation to gender, age, smoking behaviour, coffee- and grapefruit consumption and medication in a large liverbank (n=235). For the first time, the results showed the association of some of the alleles, especially the *6 allele, with a reduced protein content and enzyme activity. A significant correlation of expression and activity influenced by age, gender or environmental factors was not observed. An effect due to induction of CYP2B6 expression was however observed in patients treated with the antiepileptic drug carbamazepine and the analgesic metamizol. The CYP2B6 polymorphisms could be analyzed in different cooperations to clinical trials with several disease backgrounds. CYP2B6 and Morbus Parkinson: Neurological substances as selegiline (in Parkinson therapy) and other xenobiotics (nicotine) are metabolized by CYP2B6, which is also expressed in the brain. A possible association analysis of CYP2B6 polymorphisms and Parkinson’s disease was done in a case-control study, for which polymorphisms are described as risk factors in other drug-metabolizing enzymes. This genotype testing revealed no significant frequency difference between patients and healthy controls. An exclusion of an influence of CYP2B6 in the Parkinson’s disease development can however not be postulated, because the effect of some polymorphisms can occur together with specific toxic substances. This can be analysed by more specific research. CYP2B6 and HIV-therapy: Newly found and rare CYP2B6 mutations were not described in their functional relevance for the HIV therapy. The genotyping results of DNA samples of several HIV populations impressively showed the association of the*6 allele both with reduced protein expression and Efavirenz hydroxylation in vitro and in the clinical Efavirenz therapy. For the first time, this was a large-scaled analysis of the *6 allele and also some seldom loss-of-function alleles, which extensively increase the predictivity for unexpected high plasma levels of this HIV drug. The used techniques and results of this work can help to optimize drug therapy for CYP2B6 substrates in the future. They underline the value of CYP2B6 genotyping predictive for drug dependent dosage to prevent adverse events and improve therapy response.