Expression, Charakterisierung und Optimierung mikrobieller Laccasen für die Biokatalyse

Abstract

Laccasen (E.C. 1.10.3.2.) gehören zu den Multikupferoxidasen und katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substratmolekülen durch die Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Besonders aus Weißfäulepilzen wurden viele Laccasen beschrieben und in der Biokatalyse eingesetzt. Bisher wurden jedoch hauptsächlich natürlich vorkommende Mischungen von Laccasen aus Weißfäulepilzen und nicht isolierte Enzyme verwendet. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Laccasen aus verschiedenen Mikroorganismen exprimiert und charakterisiert sowie auf ihre Einsetzbarkeit in der Biokatalyse untersucht werden. Die Aktivität der Laccasen bei der oxidativen Kupplung phenolischer Säuren sowie der Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe stand dabei im Vordergrund. Zudem sollte die häufig geringe Expression der Laccasen verbessert und gemeinsam mit der Aktivität der Enzyme über gezielte Mutagenese oder Zufallsmutagenese gesteigert werden.

Vier verschiedene Laccasen aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma und Lccdelta, wurden erfolgreich in Pichia pastoris überexprimiert. Die Wahl der Signalsequenz zur Sekretion in P. pastoris sowie die Temperatur hatten einen großen Einfluss auf die Expression der Laccasen. Durch Hochzelldichte-Kultivierungen von P. pastoris wurden hohe Ausbeuten der Laccasen von bis zu 3400 U l–1 erzielt, die den biotechnologischen Einsatz dieser Enzyme realisierbar machen. Die biochemische Charakterisierung der Laccasen ergab, dass Lccalpha und Lccbeta bei Raumtemperatur wie auch bei höheren Temperaturen deutlich stabiler als Lccgamma und Lccdelta waren. Zudem zeigten die Laccasen sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Obwohl alle vier Isoenzyme die oxidative Phenolkupplung von 5 mM Sinapinsäure regioselektiv zum Dehydrodisinapinsäuredilakton katalysierten, zeigte Lccdelta mit 98% Umsatz nach 20 min die höchste Aktivität. Lccalpha, Lccbeta und Lccgamma wiesen nach 20 min 34%, 50% bzw. 48% Umsatz auf. Die Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasser-stoffe erfolgte hingegen am effektivsten mit Lccbeta. Durch Einsatz des Redoxmediators 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS) wurde mit Lccbeta nach 72 h über 80% Umsatz von 0,1 mM Anthracen, Acenaphthen und Acenaphthylen erzielt und damit deutlich bessere Ergebnisse erreicht als bisher mit Laccase-Mischungen aus T. versicolor und ABTS. Lccbeta wurde somit als stabilste Laccase aus T. versicolor mit hoher Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten identifiziert und ist potenziell für einen Einsatz in der Biokatalyse geeignet. Strukturelle Analysen der Laccasen und anschließende Mutagenese zeigten, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der Laccasen gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen durch die Aminosäuren an Position 164 und 265 in der Substratbindetasche verursacht werden.

Des Weiteren wurde eine neue Laccase aus Bacillus licheniformis identifiziert und erfolgreich in Escherichia coli überexprimiert. Das Enzym CotA katalysierte die oxidative Kupplung verschiedener phenolischer Säuren, allerdings war die Aktivität des Enzyms stark von der Alkylkettenlänge der Säureseitengruppe wie auch von den Substituenten in ortho-Position der Phenolgruppe abhängig. So wurden 5 mM Sinapinsäure, Kaffeesäure und Ferulasäure von CotA nach 120 min zu 66%, 22% bzw. 15% umgesetzt, während p-Cumarsäure, Zimtsäure und Vanillinsäure nicht oxidiert wurden. Als Hauptprodukte der Kupplungsreaktionen wurden Dimere der Säuren identifiziert. Die höchste Regioselektivität bei der oxidativen Phenolkupplung wurde bei der Oxidation von Sinapinsäure zum Dehydrodisinapinsäure-dilakton erreicht (79% Anteil am Gesamtprodukt). Syringasäure wurde von CotA ausschließ-lich zum 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon oxidiert (22% Umsatz nach 120 min).

CotA wurde durch Zufallsmutagenese (error-prone PCR) verändert und 6000 CotA-Varianten im Hochdurchsatzverfahren auf verbesserte Aktivität gegenüber ABTS untersucht. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde anschließend über einen rationalen Ansatz die CotA-Variante K316N/D500G erzeugt. Diese konnte 11,4-mal so stark wie der Wildtyp exprimiert werden. Das bedeutet, dass circa 300 mg aktive Laccase aus 1 l E. coli-Kultur erhalten werden können. K316N/D500G zeigte zudem eine um circa 50% höhere spezifische Aktivität bei der oxidativen Phenolkupplung von Ferulasäure als der Wildtyp. Die Aktivität gegenüber Kaffeesäure war leicht erhöht (20% Umsatz gegenüber 18% Umsatz mit CotA). Außerdem wurden die Farbstoffe Remazol Brilliant Blue R, Alizarin Red S und Indigocarmin von K316N/D500G sowohl in An- wie in Abwesenheit des Redoxmediators Violursäure deutlich stärker entfärbt als von CotA-Wildtyp. Die verbesserten Eigenschaften der CotA-Variante K316N/D500G ermöglichen den Einsatz dieser bakteriellen Laccase in der Biokatalyse.

Laccases (E.C. 1.10.3.2.) belong to the group of multicopper "blue" oxidases and catalyze the four-electron reduction of molecular oxygen to water by one-electron oxidation of four substrate molecules. Especially from white-rot fungi many laccases have been described and used in synthesis and degradation reactions. In most cases, natural occurring mixtures of laccases from white-rot fungi, but not isolated enzymes have been applied so far. In this thesis, several laccases from different microorganisms were expressed and characterized and their applicability for biocatalysis was investigated. Thereby, the activity of the laccases in oxidative phenol coupling as well as in oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons was of special interest. Low heterologous expression levels of laccases still hamper the biotechnological application of these enzymes. Thus, the expression of laccases should be optimized in this work as well.

Four different laccases from the white-rot fungus Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma and Lccdelta, were successfully expressed in Pichia pastoris. The signal sequence for secretion in P. pastoris as well as the temperature had a major impact on the expression of the laccases in this host. High cell density fermentations of P. pastoris yielded volumetric activities of laccases of up to 3400 U l-1. Biochemical characterization of the laccases showed, that Lccalpha and Lccbeta were much more stable than Lccgamma and Lccdelta at both room temperature and at elevated temperatures. Furthermore, the catalytic activities of the laccases were quite different. Although all four isoenzymes catalyzed the oxidative phenol coupling of 5 mM sinapic acid to dehydrodisinapic acid dilactone, Lccdelta showed the highest activity with 98% conversion after 20 min. Only 34%, 50% and 48% conversion have been reached with Lccalpha, Lccbeta and Lccgamma, respectively, after 20 min of reaction. The highest activity towards polycyclic aromatic hydrocarbons was obtained with Lccbeta. In the presence of the redox mediator ABTS over 80% conversion of 0.1 mM anthracene, acenaphthene and acenaphthylene was reached with Lccbeta after 72 h. Thus higher conversions have been achieved using the Lccbeta-ABTS system compared to results described in the literature with laccase mixtures from T. versicolor and ABTS. From these results, Lccbeta was identified as the most stable laccase of T. versicolor with a high activity towards various substrates and is potentially applicable in biocatalysis. Structural analysis of laccases followed by mutagenesis demonstrated the impact of positions 164 and 265 located at the substrate binding sites on activity of laccases towards polycyclic aromatic hydrocarbons.

Furthermore, a new laccase from Bacillus licheniformis was identified and successfully expressed in Escherichia coli. This enzyme referred to as CotA catalyzed the oxidative coupling of different phenolic acids. The activity of CotA strongly depends on the alkyl chain length of the acid side group and the substituting groups in ortho-position of the phenol group. CotA showed after 120 min of reaction 66%, 15% and 22% conversion of 5 mM sinapic acid, ferulic acid and caffeic acid, respectively, while p-coumaric acid, cinnamic acid and vanillic acid were not oxidized at all. The main products of the oxidative coupling reactions were identified as dimers of the phenolic acids. Highest regioselectivity during dimerization reactions was observed with sinapic acid as substrate. It was oxidized to dehydrodisinapic acid dilactone (79% of the total products). Syringic acid was oxidized by CotA exclusively to 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone (22% conversion after 120 min).

CotA was changed by random mutagenesis (error-prone PCR) and 6000 CotA variants were screened in a high-throughput system for increased activity towards ABTS. Based on the obtained results, the CotA-variant K316N/D500G was constructed using a rational approach. Expression level of this mutant was 11.4-fold higher than that of the wild type enzyme. Thus, approximately 300 mg of active laccase can be obtained from 1 l of E. coli culture. Furthermore, the specific activity of K316N/D500G in oxidative phenol coupling of ferulic acid was increased by 50% compared to CotA wild type. The specific activity towards caffeic acid was slightly increased (20% conversion compared to 18% conversion by CotA). Moreover, decolorization of the dyes remazol brilliant blue R, alizarin red S and indigo carmine by K316N/D500G was significantly higher both in the presence and absence of the redox mediator violuric acid as compared to the wild type. The improved properties of K316N/D500G allow for the application of this bacterial laccase in biocatalysis.