04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Allele-specific epigenome editing : development and clinical application(2024) Kouroukli, Alexandra; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Item Open Access Alternative active site confinement by enforcing substrate pre-organization in cyclases(2023) Schell, Kristina; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Confinement of an enzyme’s active site is critical to the efficiency of chemical reactions and has been recognized as an important tool for catalysis. Confined active sites facilitate the pre-organization of substrates and intermediates to control the reaction course, protect against premature quenching and provide unique products. The catalytic center activates the substrate, and its activity can be enhanced by residues surrounding the substrate in the active site, changing the local catalyst geometry, and maintaining a constrained structural and/or electronic configuration of the catalytic center. These properties are characteristic of confinement, resulting in the generation of proximity between the substrate and the catalytic center, as well as complementary binding of the substrate into the active site. Effectively, this accelerates the reaction, controls the progress of the reaction, and positions the substrate in a productive conformation. The reaction course is selectively controlled by the stabilization of intermediates and by the interaction of electron-rich residues with electron-poor molecules and vice versa. Despite these benefits, a strongly confined active site is inherently limited to compounds that resemble the native substrate, with only small deviations tolerated. This restricts the applications for new reactivities and prevents broad substrate scopes. In this work, analysis of the enzyme structure in combination with iterative saturation mutagenesis were employed for the development of biocatalysts with alternative confinement and productive substrate pre-organization. To unlock the potential of confined Brønsted acid catalysts this approach was applied on terpene synthases. These enzymes form several carbocations as transition states and intermediates, which can be selectively converted by confinement of the active site. Exploiting the potential of terpene synthases to convert modified terpene scaffolds could provide interesting building blocks with branched isoprene/terpene motifs. In addition, the control of the reaction progression to specific products rather than a mixture of products could be targeted by stabilizing carbocation intermediates or transition states. The present work demonstrates a structure-guided strategy to create an alternative confinement in the squalene hopene cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC). This strategy aims to create proximity between substrate and catalytic center and complementarity between substrate and active site to obtain productive pre organization of the substrate. This may allow the conversion of geranylacetone (GA), farnesol and farnesylacetone analogs as substrates with modified isoprene patterns. Among different rational and semi-rational approaches only variant G600M (VD1), in which the substrate tunnel was modified, yielded starting activity. Structural analysis of VD1 led to the identification of a bottleneck in the tunnel. This resulted presumably in steric interactions and proximity by decreasing average distances between the double bond of the substrate’s terminal isoprene unit and the catalytic center. Furthermore, a lower fluctuation of these distances around this mean value was observed in VD1 compared to the wild type (WT). These observations support the hypothesis of improved substrate pre-organization and confirm the creation of proximity between the substrate and the catalytic center. The development of a screening method and optimization of reaction conditions facilitated iterative saturation mutagenesis to investigate the evolvability and the potential of the approach. The positions for saturation mutagenesis targeted the shape complementarity of the active site to the GA analog dihydropseudoirone, and the finally developed variant (VD5) showed an 1174-fold increase of the total turnover number and 111-fold increase in catalytic efficiency compared to the WT. Creation of alternative active site confinement demonstrates evolvability and great potential to overcome limitations in the engineering of biocatalysts and allowed the generation of novel building blocks in preparative mg scale. Limitations in the generation of alternative confinement were approached by using lycopene cyclases. These catalysts convert linear lycopene to carotenes under physiological conditions and were mainly studied for the conversion of pseudoionones in this work. The latter substrate could not be converted by AacSHC through generation of alternative confinement. Three different lycopene cyclases were tested, of which CanLCY B showed immediate activity in converting pseudoionone to a monocyclic product. AthLCY-B and AthLCY-E initially showed no conversion of selected terpenes. After optimizing the reaction conditions, a multiple sequence alignment (MSA) was performed to identify non-conserved positions around the catalytic acid of LCY-B. It was hypothesized that these amino acids influence the confinement and the pre-organization of the substrate. Saturation mutagenesis at the identified positions improved β-Ionone formation by 4-fold and conversion by 5% with variant V335L compared to the WT. The applicability of this MSA-based alternative confinement strategy for engineering of further lycopene cyclases was demonstrated by using saturation mutagenesis of the respective residues in AthLCY-E. Under optimized conditions α-Ionone product formation increased 4.5-fold with the best performing variant AthLCY-E S359F compared to WT AthLCY-E. Application of lycopene cyclases to complement activities with challenging steric interactions demonstrated the successful expansion of the diversity for protonation reactions by biocatalysts and the successful application of an MSA-based approach to generate alternative confinement. To further investigate the generation of alternative confinement and expand the toolbox of Brønsted acid catalysis, the acid isomerization of monoterpenes catalyzed by squalene hopene cyclases (SHCs) was investigated. To access selective product formation with monoterpenes a strategy based on cation stabilization was applied to overcome the challenging pre-organization of the cyclic C10 compounds. The focus was on aromatic residues with high electron density and residues surrounding the carbocation to direct the reaction course toward a single monoterpene product. In an initial screening, four monoterpenes were converted by AacSHC, resulting in complex product mixtures. Of these, one monocyclic and one bicyclic substrate were selected for further engineering. The goal here was to increase the formation of terpinen-4-ol, a hydrated monoterpene. In addition, limonene that was not converted by AacSHC was tested. Optimization of reaction conditions and semi-rational engineering to stabilize the carbocation intermediate produced improved variants in terms of selectivity and terpinen-4-ol formation. Saturation mutagenesis of hydrophobic amino acids that interact with the docked substrate and surrounding residues resulted in variants VT3 and VS2, which had the best selectivity and the highest measured terpinene 4-ol formation, respectively. VT3 converted monocyclic terpinolene with a selectivity of 64% and with a 3.4-fold increase in total turnover number (TTN) compared to the WT. The highest terpinene-4-ol formation of 219 µM and a 2-fold increase in TTN compared to the WT was measured with the bicyclic compound sabinene. Features, such as bulkier residues at position 600, found in VT3 and VS2 are likely responsible for generation of alternative confinement by the positioning of aromatic residues, which stabilize cationic intermediates along the reaction trajectory towards terpinene-4-ol formation. Creating alternative confinement shows great potential for overcoming limitations in biocatalyst engineering. Interesting building blocks were generated and new reactivities with improved selectivity in protonation reactions have been discovered. Moreover, this strategy could be used for predicting potential hot spots in enzyme engineering campaigns and data-driven predictions of enzyme functions to decipher the catalytic potential of enzyme scaffolds.Item Open Access Application and engineering of targeted DNA methylation editing tools for the modulation and characterization of the epigenome network(2022) Broche, Julian; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Despite of the large variety of different cell types in humans, all cells carry the same genetic information. In order to enable a cell type-specific expression profile, a multitude of epigenetic signals has to be established and maintained by various epigenetic mechanisms. Histone post-translational modifications and DNA methylation are two major epigenetic signals and parts of the epigenome network, which regulate the activation or silencing of gene expression by modulating the chromatin accessibility. In mammals, DNA methylation patterns are established by DNA methyltransferases, and aberrant methylation patterns have been connected to various disorders including cancer. Thus, it is of particular interest for basic research and medical applications to gain a better understanding of this mark, and to artificially manipulate the DNA methylation state at a certain locus. This can be achieved by the employment of diverse epigenome editing tools, termed ‘EpiEditors’, allowing to install or remove DNA methylation with variable specificity. Aim of the main part of this PhD work was to characterize the stability of DNA methylation at CpG islands (CGIs) after artificial introduction. For installation of DNA methylation, a zinc finger (ZnF) was used as targeting device, which has a short DNA binding motif allowing to target numerous genomic loci simultaneously. By conducting ChIP experiments, more than 15,000 ZnF peaks were identified, demonstrating its promiscuous binding in the genome. The fusion of the DNMT3A catalytic domain (3AC) to the ZnF enabled to deposit DNA methylation at thousands of CGIs. Afterwards, the dynamics of this mark were tracked for up to 11 days by MBD2-seq. Strikingly, the installed DNA methylation was only transient at around 90 % of all previously unmethylated CGIs. However, high levels of residual DNA methylation were observed at 10 % of the CGIs. Intriguingly, these stably methylated CGIs were strongly enriched in H3K27me3, a mark associated with Polycomb group chromatin. The deposition of DNA methylation resulted in a marked reduction of the activating marks H3K4me3 and H3K27ac, which were partially recovered upon DNA methylation loss. Surprisingly, no direct effects of DNA methylation were observed on H3K9me3 and H3K36me3 levels. However, the expression of more than 900 genes was downregulated at least two-fold after DNA methylation editing of the corresponding promoter, demonstrating the high silencing capacity of the mark. Thereby, the expression changes were tightly correlated to the temporal changes promoter methylation levels. In the second project of this thesis, the goal was to develop an improved EpiEditor, capable to introduce DNA methylation with high efficiency at the target locus but with low off-target activity. For this, two dCas9-based targeting strategies in combination with two different effector domains, 3AC and a chimeric construct of 3AC fused to the C-terminal domain of DNMT3L (3AC-3L), were compared. The direct fusion of the effector domains to dCas9 resulted in a lower specificity than a connection of dCas9 and effector domain with a dCas9-SunTag system, which is based on the recruitment of multiple antibody-fused effector domains to an array of GCN4 peptides fused to dCas9. Although a high specificity of the dCas9-SunTag system in combination with 3AC was observed, the DNA methylation efficiency was rather low. In contrast, dCas9-SunTag together with 3AC-3L was more efficient, but on genome-wide scale, the off-target activity was very high. By introducing charge-reversal mutations into basic residues required for the interaction of 3AC-3L with DNA, most of the off-target activity of the EpiEditor could be removed without compromising its on-target activity strongly. In the end, the novel EpiEditor outperformed the previously available dCas9-SunTag construct in combination with 3AC. The third project of this work aimed to reprogram the H19/IGF2 imprinting control region (ICR) by targeted DNA demethylation. To this end, the dCas9-SunTag system in combination with the catalytic domain of TET1 was employed. Multiple CpG-rich motifs within the ICR were targeted by using a multi-sgRNA plasmid. Strikingly, a strong reduction in DNA methylation was obtained. By conducting CTCF-ChIP, it could be demonstrated that the DNA demethylation was accompanied by the recruitment of the methylation-sensitive insulator protein CTCF. The reduced DNA methylation and the increased CTCF occupancy were maintained for almost four weeks, indicating the robustness of the reprogrammed state. All in all, the obtained data provide valuable information on the dynamics of targeted DNA methylation and its regulatory effects. In combination with the development of better EpiEditors, this PhD work may pave the way towards safer and more efficient clinical applications of EpiEditing.Item Open Access Biosynthese von N-Heterocyclen mittels Putrescinoxidase und Iminreduktase(2018) Weinmann, Leonie; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer neuen Enzymkaskade zur Synthese von N-Heterocyclen. Vor allem chirale N-Heterocyclen bilden wichtige Vorstufen für die Synthese von Pharmazeutika oder Agrochemikalien und sind daher von besonderem industriellem Interesse. Über 90% der potenziellen pharmazeutischen Wirkstoffe beinhalten Stickstoff und viele davon in Form von substituierten Piperidinderivaten, weswegen stetig nach neuen Synthesewegen gesucht wird. Für die Entwicklung einer neuen alternativen Enzymkaskade wurden die Putrescinoxidase von Rhodococcus erythropolis (PuO-Re) und die (R)-selektive Iminreduktase von Streptosporangium roseum (IRED-Sr) oder die (S)-selektive Iminreduktase von Paenibacillus elgii (IRED-Pe) gewählt um chirale N-Heterocyclen ausgehend von Diaminderivaten, die z.B. über die Decarboxylierung von Aminosäuren zugänglich sind, herzustellen. In dieser Kaskade oxidiert die PuO-Re eine Aminogruppe der Diamine, wodurch ein Aminoketon entsteht. Dieses Aminoketon cyclisiert spontan unter Bildung einer Schiff-Base, dieses Imin kann dann von der Iminreduktase mit dem Kofaktor NADPH zum gesättigten N-Heterocyclus reduziert werden. Da die Aktivität der PuO-Re für längerkettige oder verzweigte Diamine im Vergleich zum natürlichen Substrat 1,4-Diaminobutan drastisch abnimmt, wurde ein semi-rationales Design durchgeführt um die Aktivität gegenüber Diaminopentanderivaten zu steigern und das Substratspektrum zu erweitern. Dabei konnten zwei Varianten identifiziert werden, die eine gesteigerte Umsatzzahl für ebendiese Substrate aufweisen. Um eine weitere Steigerung der Aktivität zu erreichen wurde ein rationales Design für die aktive Tasche angewendet, dabei konnte eine Variante erstellt werden, die aliphatische Monoamine als Substrat akzeptiert und weitere zwei Varianten mit gesteigerter Aktivität gegenüber 1,5-Diaminohexan. Mit der Variante, die aliphatische Monoamine als Substrate akzeptiert, konnte gezeigt werden, dass die PuO-Re bei verzweigten Aminen, die weniger gehinderte Aminogruppe oxidiert. Alle positiven PuO-Re Varianten wurden erfolgreich mit den beiden IREDs kombiniert und die beste Umsetzung eines substituierten Diamins resultierte in vitro in 90% Produktbildung. Erstaunlicherweise konnte bei der Umsetzung von 1,5-Diaminohexan zu 2-Methylpiperidin in der Kaskade ein Switch im Enantiomerenüberschuss, zwischen den PuO-Re Varianten aus dem semi-rationalen Design und dem rationalen Design der aktiven Tasche, beobachtet werden. Somit konnte in der aktiven Tasche die Position 206 identifiziert werden, die verantwortlich ist für die Unterscheidung der Enantiomere von 1,5-Diaminohexan. Des Weiteren wurde die Kaskade mit einer der PuO-Re Variante in Kombination mit der IRED-Sr in ein in vivo System übertragen. Dabei konnte durch Variation des E. coli Stammes und durch Reaktionsoptimierung die Produktbildung von 3-Methylpiperidine aus 1,5-Diamino-2-methylpentan von 10% auf 83% gesteigert werden. Eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen in Kooperation mit Sanofi führte zu einer Umsetzung von fast 30 mM 1,5-Diamino-2-methylpentan zu 3-Methylpiperidin in einem 20 L Reaktor.Item Open Access CRISPR-Cas9 fusions for synthetic epigenetics(2020) Stepper, Peter; Jurkowski, Tomasz (Jun.-Prof. Dr.)Item Open Access Data integration and data mining for the exploration of enzymatic sequence-structure-function relationships(2018) Buchholz, Patrick C. F.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Item Open Access Design of artificial functional and regulatory systems in bacteria(2017) Maier, Johannes A. H.; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Item Open Access Development and application of fluorescent reporter assays for the investigation of chromatin regulation(2021) Pinter, Sabine; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Item Open Access Development of artificial single and double reading domains to analyze chromatin modification patterns(2018) Mauser, Rebekka; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)The unstructured N-terminal tails of histone proteins carry many different post-translational modifications (PTMs), like methylation, acetylation or phosphorylation. These PTMs can alter the chromatin structure, influence the interaction of adjacent nucleosomes and serve as specific binding sites for histone interacting domains. Currently, the investigation of histone tail PTMs is mainly based on antibodies, however concerns about the specificity of these antibodies and reproducibility of data arouse. Therefore, it was one aim of this thesis to develop alternative approaches to histone tail PTM antibodies. Previous studies already showed that histone modification interacting domains (HiMIDs) can replace histone tail antibodies in a highly effective manner. As part of this work, the TAF3 PHD domain was established as new H3K4me3 specific HiMID. In peptide array binding and Far-western blot assays, the domain showed a specific interaction with H3K4me3 modifications. Also in ChIP like experiments (CIDOP: Chromatin Interacting Domain Precipitation) coupled to qPCR and next generation sequencing, the domain showed a similar performance as validated H3K4me3 antibodies. With the proposal of the histone code hypothesis the question was raised if combinations of histone modifications carry specific biological functions. However, so far, the experimental analysis of the co-occurrence of histone modification on the same nucleosome in a genome-wide manner is a challenging task. For this reason, the main aim of this work was to develop double reading domains in which two histone reading domains are fused together with a flexible linker to achieve simultaneously readout of dual histone tail modifications in a single CIDOP experiment. To validate the concept, the Dnmt3a PWWP domain and the MPP8 Chromo domain were fused together and their specific recognitions of H3K36me2/3 and H3K9me3 histone tail modifications were analyzed. Biochemical investigations like peptide arrays, Far-western blot and western blot experiments showed that both domains specifically interact with their targets and preferentially interact with double modified chromatin. Additionally, the preferred interaction with double modified chromatin could be further verified with binding pocket mutants and methyl-lysine analogues. The newly generated double domain was used in chromatin precipitation experiments to identify genome regions where both modifications are present. The genome-wide distribution of the H3K36me2/3-H3K9me3 showed that this combination of histone marks represents a novel bivalent chromatin state, which is associated with weakly transcribed genes and is enriched for binding sites of ZNF274 and SetDB1. Also in this work, mixed peptide arrays were introduced as new screening method for the efficient analysis of double reading domains. The naturally occurring double reading domain of the BPTF protein was used to demonstrate the capability of this new screening tool. BPTF contains a PHD domain, which binds to H3K4me3 and a Bromo domain, which interacts with acetyl groups of the H4 tail. Synergistic binding to both peptides was shown using the newly developed mixed peptide arrays. Additionally, in the course of this work mixed peptide arrays were used to optimize several of the designed double reading domains. Furthermore, some other double reading domains were generated in this work, like PWWP-ATRX, MPP8 Chromo domain-L-double Tudor and CBX7 Chromo domain-L-MPP8 Chromo domain and analyzed for specific dual readout. Also double reading domains with dual specificity for DNA methylation and histone marks were generated. The firstly used methyl-DNA binding domain of the MBD2 protein showed a strong binding, dominating the effect of the HiMIDs. Therefore, the weaker but still specific methyl-DNA binding domain of the MBD1 protein was used. First experiments with this new fusion constructs showed a simultaneously interaction with chromatin which is associated with DNA methylation and histone PTMs. In summary, the studies with double reading domains showed that with this novel method precipitation of double modified chromatin is possible and that the genome-wide investigation of newly studied bivalent chromatin states is feasible. Therefore, this novel approach makes it possible to analyze many different combinations of histone modifications, investigate their influence on chromatin and gain a deeper understanding of the biological role behind histone tail modification patterns.Item Open Access DNA methyltransferase DNMT3A forms interaction networks with the CpG site and flanking sequence elements for efficient methylation(2022) Dukatz, Michael; Dittrich, Marianna; Stahl, Elias; Adam, Sabrina; De Mendoza, Alex; Bashtrykov, Pavel; Jeltsch, AlbertSpecific DNA methylation at CpG and non-CpG sites is essential for chromatin regulation. The DNA methyltransferase DNMT3A interacts with target sites surrounded by variable DNA sequences with its TRD and RD loops, but the functional necessity of these interactions is unclear. We investigated CpG and non-CpG methylation in randomized sequence context using wildtype DNMT3A and several DNMT3A variants containing mutations at DNA-interacting residues. Our data revealed the flanking sequence of target sites between the -2 and up to the +8 position modulates methylation rates >100-fold. Non-CpG methylation flanking preferences were even stronger and favor C(+1). R836 and N838 in concert mediate recognition of the CpG guanine. R836 changes its conformation in a flanking sequence-dependent manner and either contacts the CpG guanine or the +1/+2 flank, thereby coupling the interaction with both sequence elements. R836 suppresses activity at CNT sites, but supports methylation of CAC substrates, the preferred target for non-CpG methylation of DNMT3A in cells. N838 helps to balance this effect and prevent the preference for C(+1) from becoming too strong . Surprisingly, we found L883 reduces DNMT3A activity despite being highly conserved in evolution. However, mutations at L883 disrupt the DNMT3A-specific DNA-interactions of the RD loop, leading to altered flanking sequence preferences. Similar effects occur after the R882H mutation in cancer cells. Our data reveal that DNMT3A forms flexible and interdependent interaction networks with the CpG guanine and flanking residues that ensures recognition of the CpG and efficient methylation of the cytosine in contexts of variable flanking sequences.Item Open Access Engineering von Enzymtunneln : experimentelle Studie, in silico Modellierung und Simulation der Monooxygenase CYP153AM.aq(2021) Rapp, Lea R.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Enzyme werden heutzutage als flexible und hochdynamische Makromoleküle und nicht mehr als statische Strukturen betrachtet. Daher ist das klassische Schlüssel-Schloss-Modell, das 1894 von Emil Fischer postuliert wurde, mittlerweile überholt. In neueren Betrachtungen wird die Flexibilität und auch die von Liganden induzierte Dynamik der Enzyme zusätzlich berücksichtigt. Es wurde gezeigt, dass gezielte Veränderungen der flexiblen Elemente von Enzymen die dominanten Konformationen des Proteins beeinflussen, was mitunter für eine effizientere Katalyse von Vorteil sein kann. Jedoch ist der Einfluss von gezielten Veränderungen durch Mutationen der dynamischen Bereiche, besonders von Enzymtunneln, aufgrund der geringen Konservierung von Aminosäuren meist schwierig vorherzusagen und rationale Ansätze aus diesem Grund bisher eine Seltenheit. Zur Vereinfachung wird daher immer noch oftmals mit den statischen Kristallstrukturen von Proteinen für das (semi-)rationale Enzym Engineering gearbeitet. Hinzu kommt, dass viele Enzyme ihr katalytisches Zentrum nicht nahe der Oberfläche ungeschützt präsentieren, sondern tief in der Proteinstruktur verbergen, um unspezifische katalytische Reaktionen auszuschließen und das aktive Zentrum zu schützen. In diesem Fall wird das „Schlüsselloch“ dem alten Modell hinzugefügt, das den Zugang des „Schlüssels“ zum „Schloss“ reguliert. Frühere (semi-)rationale Engineering Ansätze fokussierten sich hauptsächlich auf die aktive Tasche oder deren beeinflussende Aminosäuren in einer bestimmten Nähe zum katalytischen Zentrum oder des kristallisierten Liganden. Immer mehr an Interesse gewinnt innerhalb der Biokatalyse jedoch die Erforschung und Veränderung von weiter entfernten hochflexiblen Strukturelementen wie Loopregionen und molekulare Tunnel anstelle des aktiven Zentrums. Aktuelle Forschungen an Oberflächenloops zeigen, dass diese flexiblen Loopregionen zum Teil den Eingang wichtiger Substrattunnel bestimmen. Daher wurde im Zuge dieser Dissertation das Potenzial des Tunnel Engineerings am Beispiel der P450 Monooxygenase CYP153AM.aq aus dem Organismus Marinobacter aquaeolei VT8 untersucht. Das Prinzip des Tunnel Engineerings zur Verbesserung oder Umsetzung neuer enzymatischer Funktionen ist anerkannt, wird aber experimentell noch sehr wenig genutzt, obwohl prognostische Simulationen und retrospektive Aufklärungen existieren. Zu Beginn dieser Arbeit wurde das CYP153AM.aq System im Hinblick auf die in der Kristallstruktur vorhandenen Tunnel untersucht und eine erweiterte Analyse mit dem in silico Werkzeug CAVER durchgeführt. Dabei wurden drei Enzymtunnel identifiziert: Zwei putative Substrattunnel 2c und 2e und ein Solvent Tunnel S. In einer anfänglichen Mutagenesestudie wurden die Tunnel separat durch einzelne Substitutionen der strukturbildenden Aminosäuren hinsichtlich der Umsetzung verschiedener Substrate untersucht. Basierend auf den vorherigen Studien des Enzyms wurden diese Varianten auf die Spezifität hinsichtlich Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen (C8, C12 und C16) evaluiert. Da für diese Arbeit unter Anderem kürzerkettige Moleküle (C8) von Interesse waren, wurden aus der Klasse der Alkane n-Octan und zusätzlich das Alken trans-2-Octen getestet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Mutationen in den Tunneln 2c und 2e die Umsetzung und die Spezifität hinsichtlich verschiedener Substrate beeinflussen. Drei Positionen stachen dabei besonders hervor: M228 zeigte je nach Mutation Einfluss auf den Substratumsatz in Abhängigkeit von der Kettenlänge der Substrate, Q129 und V141 beeinflussten vor allem die Umsetzung kürzerkettiger Substrate. Werden diese Aminosäurereste in der Kristallstruktur betrachtet, fällt auf, dass sie ein Dreieck um den Tunnel 2c bilden und teilweise den Tunnel 2e begrenzen. Für die nachfolgende Mutagenesestudie an den oben genannten Aminosäuren wurde die Octansäure als Zielsubstrat gewählt. Besagte Reste wurden mittels Sättigungsmutagenese verändert und eine Variantenbibliothek erstellt. Um Varianten mit verändertem Produktspektrum zu identifizieren, wurde ein P450-Ganzzell-Screening auf Basis der indirekten Produktdetektion mittels Wasserstoffperoxid / HRP-vermittelter Oxidation des Farbstoffs ABTS angepasst. Mit drei unterschiedlichen semi-rationalen Mutagenese Ansätzen, die auf Struktur-Sequenz-Alignments der 3DM-Datenbank und Kristallstrukturen von CYP153AM.aq und dem homologen CYP153AP.sp basieren, wurden moderate Auswirkungen auf die Produktbildung erzielt. Durch die anschließende Kombination der besten Hits konnte eine Zweifach- (M.aqRT) und schließlich eine Dreifachvariante (M.aqRLT) generiert werden, die die effiziente ω-Hydroxylierung von Octansäure ermöglichen. M.aqRLT zeigte eine 151-fach verbesserte katalytische Effizienz und eine stark erhöhte Substratbindung (25-fach verringerter Km im Vergleich zum Wildtyp). Mithilfe von molekulardynamischen Simulationen konnten neue Erkenntnisse über die Dynamik des Enzyms gewonnen und aus den Mutationen resultierende Modifikationen der Tunnelstruktur verdeutlicht werden. Eine stark reduzierte Flexibilität und ein neuer Bottleneck des Tunnels 2c stellten sich als Hauptmerkmale der generierten Varianten heraus, die für die Stabilisierung des Enzym-Substrat-Komplexes und die Steigerung der katalytischen Effizienz verantwortlich sind. Die Interaktion des von S. Hoffmann beschriebenen Arginins als Fettsäureanker, Q129R, mit dem Carboxylat der Octansäure führt zu deren Stabilisierung in der reaktiven Konformation, wodurch die Aktivität der Variante M.aqRLT gegenüber Octansäure stark gesteigert wird. Durch die Generierung eines artifiziellen Fusionskonstrukts M.aqRLT-PFOR und der in vivo Vorausschaltung einer Thioesterase, die vermehrt Octansäure bildet, wurde die de novo Produktion von 129 ± 5 µM ω-Hydroxyoctansäure als Anwendungsbeispiel gezeigt. Im finalen Teil der Arbeit wurde durch gezieltes Engineering innerhalb der Tunnel die Substratpräferenz von CYP153AM.aq zu Dodecylamin, einem inhibierend wirkenden Fettamin, verändert. Um die Variantenbibliothek direkt aus 96-Deepwell Platten zu messen, wurde eine auf LC/MS-basierende Screeningmethode etabliert und angewendet. Durch die Umgehung einer chromatographischen Trennung der Analyten konnte die Messzeit erheblich, von 5,5 Minuten auf 36 Sekunden je Probe herabgesetzt werden. Während das verwendete Dodecylamin auf den Wildtypen als Inhibitor wirkt (IC50 = 0,9 µM) konnte durch gezielte Mutagenese an den in dieser Arbeit identifizierten Hotspots eine Variante, M.aqESE, generiert werden, die den bisherigen Inhibitor als ein neues Substrat akzeptiert (10 TON h-1). Durch das Einbringen von zwei Glutaminsäuren wurde die Aminogruppe im Tunnel fixiert und daran gehindert an das katalytisch aktive Eisen zu koordinieren, was den inhibierenden Effekt auslöst. Es zeigte sich, dass die generierten Varianten weniger durch das Amin gehemmt werden und gleichzeitig weniger affin zur Säure sind, da die Säuregruppe von den Glutaminsäureresten abgestoßen wurde. Im Verlauf dieser Arbeit konnte deutlich gezeigt werden, welche enormen Effekte durch Enzym Engineering an Tunnelstrukturen generiert werden können und welches Potenzial in der Kombination von experimentellen Versuchen und der computergestützten Modellierung und Simulation zum tiefergehenden Verständnis von Enzymen und Enzymkatalyse liegt.Item Open Access Enzymatische Dehydratisierung kurzkettiger Alkenole(2019) Fischer, Max-Philipp; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Enzymatische Hydratisierung kurzkettiger Fettsäuren und Alkene(2018) Demming, Rebecca M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Enzymkatalysierte regioselektive N-Methylierung und N-Alkylierung von Pyrazolen(2021) Bengel, Ludwig L.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access EPIC’RISPR: a modular and inducible platform for highly parallel synthetic epigenetics and chromatin imaging in a high-throughput format(2021) Oberacker, Phil; Jurkowski, Tomasz P. (Dr.)The epigenome describes the sum of epigenetic states in an organism. It consists of biochemical modifications of the DNA and histone proteins, non-coding RNAs and the three-dimensional architecture of the genome. These modifications and structures regulate the genome expression in a cell-type-specific pattern and hence control the development of the whole organism. Research in this field yielded a lot of descriptive information about the correlation between epigenetic marks and gene expression. Unfortunately, we do not know much about the causalities within the epigenetic network. With the discovery of the groundbreaking CRISPR/Cas9 technology, it is now possible to interfere with the epigenetic program. This methodology, which is known as epigenetic editing, allows the recruitment of effector molecules to distinct targets where they introduce or remove specific modifications. By observing the response of the epigenome, we can conclude how the epigenetic network functions. However, this system is somewhat limited regarding the simultaneous modification of multiple loci, which is a necessity for investigating a network. In this thesis, I combined the targeting and recruiting functionality of the CRISPR/Cas9 system in one molecule, the gRNA. Like this, this EPIC’RISPR platform can recruit numerous effector molecules to one or multiple targets simultaneously without interference. I demonstrated this by activating and repressing three target genes with different effector domains at once and by recruiting different fluorophores to several target loci. I further applied this technology to perturb five differently expressed target genes simultaneously with one effector molecule at a time. For this, I performed a large-scale experiment in which I probed the effects of more than 60 epigenetic effector molecules on target gene transcription. I identified several promising candidates which might exhibit synergistic behaviour and hence a stronger and longer-lasting impact on the epigenetic program. Furthermore, I developed ON- and OFF-switches for the EPIC’RISPR system which utilize small molecules to fine-tune the introduced effects arbitrarily. The OFF-switch was further applied for transgene expression control, extending the functionality of this system even further. Additionally, our group developed protocols for the synthesis and functionalisation of paramagnetic beads and their application in the automated high-throughput extraction of nucleic acids. Since its publication, our platform, which we call Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) has since become a hub for collaborations in open-source science, especially during the COVID-19 pandemic.Item Open Access Etablierung und Charakterisierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase für die Bioelektrokatalyse in einem dreidimensionalen CNT-Solgel Elektrodensystem(2019) Darimont, Dominique; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Motivation dieser durch das BMBF finanzierten ElektroZym Projekts ist die Überwindung der Limitation einer geringen spezifischen Produktleistung der bisher etablierten elektrochemisch getriebenen Cytochrom P450 Monooxygenase (CYP) Applikationen. Diese Applikationen wurden als Alternative zur meist unselektiven chemischen Metall-katalysierten Hydroxylierung entwickelt und stellen unterschiedliche hydroxlierte Produkte zur Verfügung. Dabei sind vor allem hydroxylierte Fettsäuren (OHFA) von Bedeutung, welche als Bausteine (building blocks) zur Synthese von z.B. Geruchs und Geschmackstoffen verwendet werden. Momentan sind diese OHFAs aufgrund der hohen Herstellungskosten nicht kommerziell verfügbar. Das Ziel des Projekts ist die Immobilisierung eines CYP Enzyms in einer dreidimensionalen, auf einer Solgel Matrix basierenden Elektrode. Die kovalente Immobilisierung von CYP Enzymen auf einer planaren Elektrodenoberfläche führt im Idealfall zu einer einfachen Oberflächenbedeckung (Monolayer) der Elektrode mit reduzierbarem Enzym. Die CYP Elektroden sind aufgrund der geringen Oberfläche in ihrer spezifischen Produktleistung stark limitiert. Daher wurde ein optimiertes CYP Enzym für den Einsatz auf Kohlenstoffnanoröhren (CNT) basierten Elektroden etabliert. Als Enzym diente das von einer zusätzlichen Reduktase unabhängige (autarke) CYP 102A1 aus Bacillus megaterium (P450 BM3). Für eine in situ Aktivitätsbestimmung wurde das Enzym auf den Umsatz von Anilin zum elektroaktiven Aminophenol optimiert. Vier Enzymmutanten wurden zusätzlichen mit einer C-terminal lokalisierten und CNT-affinen Petidsequenz (CNT-tag) modifiziert. Diese werden im Folgenden als Modell Proteinvarianten bezeichnet. Diese Sequenz erlaubt die eigenständige und orientierte Anlagerung des Enzyms an der CNT Oberfläche und erleichtert die elektrochemische Hämeisenreduktion des Enzyms entscheidend. Die Hämeisenreduktion dieses P450 BM3 Konstruktes erlaubt die elektrochemisch getriebene enzymatische Hydroxylierung von Anilin. Diese elektrochemisch enzymatische Hydroxlierung erreichte 78 % der Aktivität, der Nicotinamid-abhängigen Susbtratumsetzung. Das CNT-tag modifizierte Enzym wurde ebenfalls für die erfolgreiche „proof-of-concept“ Etablierung einer dreidimensionalen CNT-Solgel Matrix Elektrode verwendet und die spezifische Produktleistung erreichte das dreifache Niveau einer verfgleichbaren planaren Elektrode.Item Open Access The GEF‐H1/PKD3 signaling pathway promotes the maintenance of triple‐negative breast cancer stem cells(2019) Lieb, Wolfgang S.; Lungu, Cristiana; Tamas, Raluca; Berreth, Hannah; Rathert, Philipp; Storz, Peter; Olayioye, Monilola A.; Hausser, AngelikaItem Open Access Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen(2019) Borlinghaus, Niels; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Identifikation und Charakterisierung neuer Biokatalysatoren für die C-H-Oxyfunktionalisierung(2018) Klenk, Jan M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Enzymklasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen stellt in der modernen Biokatalyse eine umweltfreundliche Alternative zu der oftmals unter harschen Reaktionsbedingungen und mit limitierter Selektivität ablaufenden chemischen Synthese dar. Weiterhin sind P450s in der Lage, auch nicht-aktivierte Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen selektiv zu oxyfunktionalisieren und somit synthetische Methoden zu komplementieren sowie wertvolle natürliche Produkte unter milden Reaktionsbedingungen zu generieren. Bei dieser Enzymklasse handelt es sich um ubiquitär vorkommende, promiskuitive, hoch diverse und hoch evolvierbare Biokatalysatoren. Trotz vielseitiger Anwendungsmöglichkeiten und der einzigartigen katalytischen Eigenschaften von P450s ist aufgrund der Komplexität des Multikomponentensystems allerdings eine schrittweise Verbesserung für eine industrielle Anwendung unabdingbar, die sich verhältnismäßig aufwändig gestaltet. Die Etablierung neuer P450 Biokatalysatoren zur Generierung wertvoller oxyfunktionalisierter Medikamentenmetaboliten sowie für die Duft- und Aromastoffindustrie interessante Produkte waren Ziele der vorliegenden Dissertation. Die Natur hält in der hoch diversen P450-Superfamilie ein enormes Repertoire potenzieller Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen bereit, jedoch ist mit bislang etwa 5000 charakterisierten P450s nur ein geringer Teil der rapide wachsenden Anzahl annotierter Sequenzen (> 38000) untersucht worden. Für die Implementierung in industrielle Prozesse sind letztendlich P450-Ganzzellbiokatalysatoren aufgrund ihrer Cofaktorabhängigkeit obligat. Der Transfer der komplexen P450-basierten Prozesse in den Bioreaktormaßstab mit dem Ziel, leistungsfähige Katalysatoren unter prozessrelevanten Bedingungen zu etablieren, wurde bis dato erst sehr selten durchgeführt. Für einen solchen Ansatz wurde in einem ersten Teil dieser Arbeit die Möglichkeit zur effizienten Herstellung von oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten untersucht, deren Bereitstellung essenziell für toxikologische und ökologische Studien ist. Als Biokatalysator wurde das natürliche Fusionskonstrukt P450 RhF aus Rhodococcus sp. eingesetzt. In vorhergehenden Arbeiten konnte festgestellt werden, dass P450 RhF das nicht-steroidale Antirheumatikum (NSAID) Diclofenac unter NADPH-Verbrauch selektiv zu 5-Hydroxydiclofenac funktionalisieren kann. Dieses Enzymsystem wurde in den Bioreaktormaßstab transferiert, wobei hohe und reproduzierbare Expressionen und Produkttiter von bis zu 0,58 g L-1 erzielt werden konnten. Die Aktivität variierte dabei stark zwischen ruhenden und wachsenden Zellen. Eine Ursache hierfür stellt vermutlich die Limitierung der NADPH-Verfügbarkeit in den E. coli Zellen in Abhängigkeit vom Zellstatus dar. Darüber hinaus wurde ein weiterer Metabolit (Quinonimin) detektiert, dessen Bildung nicht-enzymatisch in Abhängigkeit von der Salzkonzentration sowie der Temperatur katalysiert wird. Die oxyfunktionalisierten Medikamentenmetaboliten sind chemisch oftmals schwer zugänglich und besitzen deshalb, ihre Verfügbarkeit vorausgesetzt, einen hohen Marktwert von mehreren hundert Euro pro mg, weshalb in dieser Arbeit neben P450 RhF an einer Plattform unterschiedlicher Katalysatoren für NSAID Hydroxylierungen gearbeitet wurde. Mit den filamentösen Pilzen Beauveria bassiana, Clitocybe nebularis und Mucor hiemalis gelang es, unterschiedliche Diclofenacmetabolite bei einer Substratkonzentration von 0,6 g L-1 in isolierten Ausbeuten über 50% in einem einfachen und günstigen Verfahren herzustellen. Darüber hinaus konnte eine bisher nicht bekannte Verbindung 3’,4’-Dihydroxydiclofenac synthetisiert werden. Auch von weiteren NSAID-Medikamenten wie Ibuprofen, Naproxen oder Mefenaminsäure wurden hohe isolierte Ausbeuten von über 99% (1 g L-1 Substrat) der hydroxylierten Metabolite erhalten; diese Ausbeuten respektive Produkttiter übertreffen bisherige Verfahren mit Mikroorganismen und heterolog exprimierten P450s um über 250%. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Identifizierung neuer Biokatalysatoren für die Oxyfunktionalisierung komplexer und sperriger Terpene, die bislang nur unzureichend biokatalytisch oder chemisch zugänglich sind. Hierbei sollten P450 Enzyme letztlich in Terpene produzierenden E. coli Ganzzellsystemen den letzten Schritt in der Biosynthese zu wertvollen Terpenoiden katalysieren. Unterschiedliche Strategien wurden zu diesem Zweck verfolgt: I) Untersuchung promiskuitiver Aktivitäten von P450s, II) Anpassung der P450s durch rationale Mutagenese, III) Suche nach neuen P450s aus Terpene metabolisierenden Organismen und IV) Suche nach homologen zu Terpene hydroxylierenden P450s. In einem ersten Ansatz wurden mit bereits charakterisierten P450-Fusionsproteinen zunächst keine promiskuitiven Aktivitäten gegenüber den Terpenen festgestellt. Aus diesem Grund wurde angestrebt, das bakterielle natürliche Fusionskonstrukt CYP116B3 aus Rhodococcus ruber dergestalt zu verändern, das breite Substratspektrum des Enzyms auf ausgewählte Terpene auszuweiten. Dies war jedoch nicht erfolgreich, weshalb als weitere Strategie nach neuen P450s in Terpen-metabolisierenden Organismen gesucht wurde. In Biotransformationen mit B. bassiana wurden erste hydroxylierte Terpene festgestellt, die auf eine Funktionalisierung durch P450s hinweisen. Durch eine Proteomanalyse konnte die Anzahl von 83 potenziellen P450s in B. bassiana pro Substrat auf ein bis vier vermutlich verantwortliche P450s reduziert werden. Allerdings misslang die funktionale heterologe Expression der eukaryotischen Gene in E. coli. Auf der Suche nach neuen P450s wurde weiterhin ein interessanter Papaverin abbauender Organismus, das gram-positive Bakterium Arthrobacter sp., getestet, das auf einigen Terpenen als alleinige C-Quelle wachsen konnte. Da die Hydroxylierung durch P450s häufig den ersten Schritt im Metabolismus von beispielsweise xenobiotischen Verbindungen darstellt, wurde Arthrobacter sp. mittels Proteomanalyse auf die verantwortlichen Enzyme hin untersucht. Die Auswertung führte zur Identifikation eines potenziellen Clusters aus zwei P450s mit den putativen elektronenliefernden Redoxpartnern, die mit dem Papaverinabbau in Verbindung gebracht werden konnten. Hinsichtlich der Terpene wurden dagegen keine Hinweise erhalten. Mit Hilfe von physiologischen oder heterologen Redoxpartnern konnte mit drei P450s aus Arthrobacter sp. eine Aktivität rekonstituiert werden, die eine weitere Charakterisierung der entsprechenden Enzyme ermöglichte. Ähnlich zu anderen Mitgliedern der CYP199A Familie akzeptierte CYP199A25 bevorzugt Benzoesäuren als Substrat, die regioselektiv in para-Position demethyliert oder hydroxyliert wurden. Bei den anderen P450s aus Arthrobacter sp. handelt es sich um Enzyme aus P450-Familien mit bislang noch unbekannter Funktion. Durch die Proteomanalyse sowie den postulierten Papaverinmetabolismus wurden Hinweise auf mögliche Phenylessigsäuren als Substrate erhalten, die experimentell bestätigt werden konnten. Die P450s CYP1232A24 sowie CYP1232F1 katalysieren im Papaverinmetabolismus die zweifache Demethylierung der 3,4-Dimethoxyphenylessigsäure zur 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure und weisen hierbei unterschiedliche Selektivitäten für die meta- und para-Position auf. Interessanterweise konnten Elektronen von den im Cluster befindlichen Redoxpartnern, eine Ferredoxin-Reduktase und ein Flavodoxin, effizient transferiert werden, was einem ersten funktionalen physiologischen P450-Klasse III System entspricht. Neben der detaillierten Charakterisierung der Substratspektren wurden Kopplungseffizienzen und kinetische Parameter der drei Enzyme untersucht sowie hoch aktive Ganzzellbiokatalysatoren entwickelt, die bis zu 1,77 g L-1 demethyliertes Produkt bildeten. Bis auf eine Aktivität von CYP1232A24 gegenüber β-Ionon in allylischer Position wurden alle getesteten Terpene jedoch nicht umgesetzt, weshalb ein bislang nicht charakterisiertes Panel aus natürlichen Fusionskonstrukten auf promiskuitive Aktivitäten hin getestet wurde. Das Substratspektrum eines Enzyms mit geringen initialen Aktivitäten gegenüber β-Ionon sowie Valencen wurde schließlich durch rationales Enzymdesign erweitert, was die Oxyfunktionalisierung einiger der ausgewählten Sesquiterpene ermöglichte. Eingesetzt in einen α-Humulen-produzierenden E. coli Stamm eines Kooperationspartners konnten durch die ITB1693 Variante F95A selektiv etwa 300 mg L-1 α-Humulen-6,7-epoxid in situ hergestellt werden. Darüber hinaus wurden auf Grundlage einer Homologiesuche zu Terpen-Hydroxylasen fünf P450s aus dem Myxobakterium Chondromyces apiculatus isoliert, wovon zwei näher charakterisiert werden konnten. Beide Enzyme sind in der Lage, eine große Bandbreite an Substraten zu akzeptieren, wobei im Iononring des β-Ionons auch nicht-allylische Positionen funktionalisiert wurden. Durch eine fokussierte Mutantenbibliothek von CYP109Q5 konnte die Selektivität weiter zu den nicht-allylischen Positionen hin verschoben und zum ersten Mal die für die Carotenoidsynthese bedeutenden und seltenen Produkte 2- und 3-Hydroxy-β-ionon simultan synthetisiert werden. Mit CYP109Q5 gelang es zudem, die komplexen Sesquiterpene umzusetzen, wobei einzelne Varianten eine zum Teil enorme Steigerung der Aktivität und Verschiebung der Selektivität aufwiesen. Ein effizientes Ganzzellsystem erlaubte schließlich die Identifizierung von Produkten ausgewählter Biotransformationen. Mit Hilfe der aktivsten Variante V80A/A280I und der Verwendung des Lösungsmittelvermittlers Cyclodextrin wurden die Hauptprodukte Longifolenaldehyd und Solavetivol synthetisiert. Letzteres dient unter anderem als Vorstufe des Solavetivons, einem wertvollen Phytoalexin. Insgesamt erwies sich CYP109Q5 als hoch evolvierbar und effizient. Die Studien dieser Arbeit zeigen, dass durch rationale Mutagenese aus dem hoch versatilen CYP109Q5-Generalisten mit einem enormen Substratspektrum (Terpene, Steroide und NSAIDs) schrittweise ein industriell wertvoller Spezialist zur Synthese spezifischer Produkte entwickelt werden kann.Item Open Access Identifizierung und Charakterisierung von Influenza-A-Virus Fusionsinhibitoren, die aus einem Doppelmyxovirus Hochdurchsatz-Screen hervorgingen(2019) Weißhaar, Marco; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)