04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Enzymatische Hydratisierung kurzkettiger Fettsäuren und Alkene(2018) Demming, Rebecca M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Generierung von gesättigten N-Heterozyklen mit Iminreduktasen(2019) Borlinghaus, Niels; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Mechanistic study on the DNA methyltransferase DNMT3A(2019) Emperle, Max; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)The phenotypical and functional diversity of mammalian cell types can be attributed to a large extent to epigenetic signals that determine and stabilize gene expression profiles. One of the most important types of epigenetic signals is DNA methylation. This modification is set early in development by the de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B, and is found predominantly at the C5 position of cytosine bases in a CpG dinucleotide context. The accurate setting of DNA methylation patterns is critical for normal development and is determined by the precise recruitment and control of DNMT activity on chromatin. In this work, four main directions of research were undertaken, with the ultimate goal of shedding novel mechanistic insights into the mechanism of DNMT3A, its regulation by chromatin signals and interaction partners, as well as the dysregulation of this enzyme in cancer. Furthermore, the potential of DNMT3A to generate 3-methylcytosine as a side reaction was explored. The DNA methyltransferase DNMT3A has been shown to multimerize on DNA and to form large multimeric protein/DNA fibers. However, it has also been postulated that this enzyme can methylate DNA in a processive manner, a property incompatible with fiber formation. By using a dedicated set of biochemical experiments, I was able to show that the DNA methylation rate of DNMT3A increases more than linearly with increasing enzyme concentration on a long DNA substrate, but not on a short 30-mer oligonucleotide, which cannot accommodate DNMT3A polymers. Methylation experiments over a range of enzyme concentrations and with substrates containing one or two CpG sites did not provide evidence for a processive mechanism. The addition of a catalytically inactive DNMT3A mutant was found to increase the DNA methylation rate by DNMT3A on the long substrate but not on the short one. Together, these data clearly indicate that DNMT3A binds to DNA in a cooperative reaction and the formation of protein/DNA fibers increases the DNA methylation rate. These results contribute mechanistic insights into the mode by which DNA methylation patterns are established during development. The second project dealt with characterizing the effects of the R882H exchange on DNMT3A. The R882H mutation is found in the DNA binding interface of DNMT3A and is frequently observed in acute myeloid leukemia (AML). By establishing a double-tag affinity purification system, I was able to show that the mutation only leads to a minor reduction in overall DNA methylation activity in mixed R882H/wildtype DNMT3A complexes. However, a pronounced change in flanking sequence preference of the DNMT3A-R882H mutant was found. Accordingly, a substrate designed to contain the target CpG site flanked by sequences preferred by R882H was better methylated by the variant than by the wildtype enzyme. Together, these data strongly argue against a dominant-negative effect of the R882H mutation and rather propose a site-specific gain-of-activity effect. These findings are in agreement with a recently determined structure of DNMT3A in complex with DNA and they might explain the high prevalence of this specific point mutation in AML. The third project was built on previous data from the lab, documenting a strong and direct interaction between the ADD domain of DNMT3A and the TRD domain of the 5mC reading protein MECP2. These experiments revealed that through its binding, MECP2 allosterically stabilizes the autoinhibitory conformation of DNMT3A, resulting in a strong inhibition of enzymatic activity in vitro. The interaction between these two proteins and its associated inhibition could be disrupted by unmodified histone H3. In my work, I further validated the interaction between the ADD and the TRD domains by size exclusion chromatography. Also, by generating cell lines with stable over-expression of MECP2, I could show that MECP2 inhibits DNMT3A activity in cells. Together, the data from this study offer unprecedented insights into the regulation of DNMT3A by the combined action of chromatin modifications and interaction partners. Accordingly, depending on the modification status of the H3 tail at the target site, MECP2 can act as either a repressor or activator of DNA methylation. The last project dealt with the coevolution between DNA methylation and DNA repair systems, a very exciting topic that was addressed in close collaboration with the laboratory of Dr. Peter Sarkies (MRC London). By performing in vitro methylation experiments with the catalytic domain of DNMT3A, I could show that, in addition to 5mC, DNMT3A can also introduce 3mC, a modification which represents an alkylation damage of DNA. This study provides a new evolutionary perspective on the loss of DNA methylation that is observed in many species.Item Open Access Squalene-Hopene cyclase catalyzed isomerization of monoterpenes(2020) Diether, Svenja; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Peptide und Fusionsproteine für die Biomineralisation von Hydroxylapatit(2021) Henkes, Thorsten Matthias; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Mittels des sogenannten Phagen Display wurden Peptide identifiziert, welche an Hydroxylapatit binden. Diese Bindemotive wurden in oberflächenaktive Fusionsproteine integriert. Die Bindung der Phagen-präsentierten Peptide, von synthetischen Peptiden und der Fusionsproteine an Hydroxylapatit sowie der Einfluss von Peptiden und Fusionsproteinen auf die Nukleation von Hydroxylapatit wurden untersucht. Ebenso wurden gebildete Präzipitate mittels SEM EDX und TEM charakterisiert. Auf diese Weise wurden Peptidmotive und Fusionsproteine identifiziert, welche die Nukleation von Hydroxylapatit beschleunigen oder verlangsamen können.Item Open Access Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 : systematische Analyse der aktiven Tasche(2017) Halder, Julia M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die gezielte Oxyfunktionalisierung von Olefinen gehört zu den am meist gesuchten Reaktionen in der Chemie. Insbesondere die Dihydroxylierung und die daraus resultierenden chiralen, vicinalen 1,2-Diole spielen hierbei eine wichtige Rolle. So werden 1,2-Diole sowohl als chirale Liganden und Auxiliare und als chirale Synthons für Pharmabausteine sowie Agrochemikalien eingesetzt. Eine schnelle und effiziente Möglichkeit für die stereoselektive, asymmetrische Sharpless Dihydroxylierung (AD) von C=C-Doppelbindungen ergibt sich aus der Metall-katalysierten Oxyfunktionalisierung mittels Osmium oder anderen Übergangsmetallen. Neben der guten Ausbeute und der hohen Selektivität, stellen jedoch vor allem die Toxizität der Katalysatoren, sowie auch die Überoxidation und Spaltung der generierten cis-Diole Herausforderungen in der Anwendung dar. Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) sind eine biologische Alternative zur rein chemischen, asymmetrischen Dihydroxylierung. In der Natur sind diese Multikomponentensysteme, bestehend aus einer hexameren Oxygenase, einem Elektronen-Shuttlemolekül und einer Reduktase, für die Dihydroxylierung von aromatischen Motiven verantwortlich und katalysieren den ersten Schritt im Katabolismus von Aromaten. Mit der Entdeckung dieser effizienten Bio-katalysatoren wurde eine umweltfreundliche Alternative zur chemisch katalysierten Sharpless AD entdeckt. Aufgrund der Verfügbarkeit von Kristallstrukturen wurde die Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 als ein Vertreter der ROs für das semi-rationale Design ausgewählt und Varianten im aktiven Zentrum des Enzyms generiert. Neben der direkten Katalyse am aromatischen Ring, wurde durch Variation der Substituenten auch die allylische Mono- bzw. die cis-Dihydroxylierung von Alkenylresten in aromatischen Molekülen (z. B. α-Methylstyrol, Allylbenzol) und die Katalyse von C=C-Doppelbindungen in nicht-aromatischen, nicht-planaren Molekülen (z. B. R-Limonen) gezeigt. Aufgrund der Vielfältigkeit dieser Enzyme besteht ein gesteigertes Interesse am biotechnologischen Einsatz, um das enorme Potential und die Vielfältigkeit des biokatalytischen Repertoires dieser Katalysatoren ausschöpfen zu können. Des Weiteren erfolgte die nähere Betrachtung der heterologen Herstellung des Biokatalystors in Escherichia coli, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Systeme betrachtet wurden. Hierbei stand im Fall der in vitro Untersuchungen das Zusammenspiel der unterschiedlichen Komponenten des Systems, das Reaktionssetup und der Einfluss des Cosolvents im Mittelpunkt. Für das optimierte in vitro System wurden schließlich folgende Parameter definiert: (I) Verhältnis der Komponenten mit 1 μM Oxygenase, 20 μM Ferredoxin und 5 μM Reduktase, (II) das Reaktionssetup mit 2 mM Substrat in Ethanol bei 30 °C für 2 h, und (III) der Anteil des Cosolvents Ethanol mit 5 %(v/v). Ein Alanin-Scan der zwölf first shell Aminosäuren lieferte im in vitro System bereits erste Indizien für relevante Mutagenese-Hotspots mit den Positionen A206, H295, L307, G204 und V260. Im Gegensatz zum in vivo System wurde im in vitro System eine deutlich erniedrigte Aktivität gegenüber den untersuchten substituierten Aromaten detektiert, weshalb auf eine mangelnde Stabilität der Komponenten im in vitro System geschlossen wurde. Im in vivo System wurde zunächst die Optimierung der Expression forciert, wobei das entwickelte Expressions- und Biotransformationsprotokoll zu einer guten Reproduzierbarkeit in Ganzzellansätzen mit Standardabweichungen von unter 5 % geführt hat. Hierzu wurden frisch transformierte Zellen zur Anzucht (37 °C) in TB-Medium verwendet und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,6-0,8 mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach 20-stündiger Expression bei 25 °C wurden eine Zellsuspension mit 0,1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) und 20 mM Glucose (0,2 gBFM/mL) für Ganzzellumsätze hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des in Ethanol gelösten Substrates gestartet und nach 20 h bei 30 °C mit der Zugabe von Lösungsmittel gestoppt. Für die in vivo Untersuchung wurde ein semi-rationaler Mutageneseansatz gewählt, indem alle first shell Aminosäuren mit Alanin, Valin und Isoleucin (36 Varianten) ausgetauscht, sowie 25 Doppelvarianten an den Positionen A206, H295 und V260 generiert wurden. Mit dieser Bibliothek erfolgte die Identifizierung von wichtigen Struktur-Funktionsbeziehungen anhand von unterschiedlich substituierten Styrolderivaten und dem Monoterpen R-Limonen. Mit dem Einbringen einer Punktmutation in der aktiven Tasche konnten deutliche Veränderungen in der Reaktions- und Substratspezifität sowie in der Regio- und Stereoselektivität (≥ 90 %) beobachtet werden, wobei die Restaktivität gegenüber dem natürlichen Substrat Naphthalen (bis > 99 %) erhalten blieb. So stellten sich die Position A206, sowie die gegenüberliegenden Positionen H295, F202, F352, V260 und L307 in der planaren, zylinderförmigen aktiven Tasche als maßgeblich für die Steuerung der Aktivität und Selektivität der NDO dar. Generell konnte eine Abnahme der Aktivität mit steigender Substituentengröße und Verzweigungsgrad (Methyl- bis Pentyl- bzw. tert-Butyl-Reste) detektiert werden. Gleichfalls konnte eine Tendenz für ungesättigte Substituenten am Aromaten beobachtet werden, wobei die Aktivität von mono- über gem-di- und trans-di-substituierte Seitenketten abnahm. Bei der Untersuchung von unterschiedlichen Methoxystyrolderivaten konnte eine gesteigerte Spezifität und Stereoselektivität (≥ 95 %ee) beobachtet werden. Neben Hydroxylierungsreaktionen wurden hierbei auch Dealkylierungsreaktionen beobachtet. Die Dihydroxylierung wurde beim Vorliegen einer zum Aromaten konjugierten C=C-Doppelbindung gegenüber der O-Demethylierung bevorzugt. Lag die C=C-Doppelbindung isoliert zum aromatischen System vor, wurde hingegen eine Präferenz für die O-Demethylierung beobachtet. Grundsätzlich hat sich die NDO als einen guten Startpunkt für die biokatalysierte, asymmetrische Dihydroxylierung erwiesen und durch die systematische Analyse der aktiven Tasche konnten essentielle Stellschrauben für die weitere Verbesserung des Katalysator identifiziert werden.Item Open Access A tribute to Isao Karube (1942-2020) and his influence on sensor science(2020) Scheller, Frieder W.; Schmid, RolfItem Open Access Enzymkatalysierte regioselektive N-Methylierung und N-Alkylierung von Pyrazolen(2021) Bengel, Ludwig L.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)