04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Einfluss DNA-bindender Proteine auf die Hybridisierungsdynamik diagnostischer DNA-Mikroarrays(2002) Schulz, GunnarIn der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Hybridisierungsdauer bei DNAMikroarrayexperimenten durch einen biochemischen Ansatz zu verringern. Dabei wurden Arrays mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern zur SNP-Detektion im β-Lactamasegen verwendet. Durch den Zusatz des Tumorsupressorproteins p53 sollte die Hybridisierung komplementärer Sonde und Probe beschleunigt werden. Von diesem Protein ist u.a bekannt, daß es einen Effekt auf die Hybridisierungskinetik von DNA-Einzelstränge in vivo und in vitro besitzt. Zur Kontrolle und Optimierung dieser p53-Aktivität wurden Hybridisierungsversuche mit fluoreszenzmarkiertem PCR-Produkt und einzelsträngigen Oligonukleotide durchgeführt. Der Nachweis von DNA-Einzel- bzw. Doppelsträngen erfolgte über deren unterschiedliches Laufverhalten in Acrylamidgelen (Band shift assay). Die Hybridisierungskinetik beider Ansätze konnte durch den Einsatz von p53 beschleunigt werden. Die in den Band shift Experimenten ermittelten Reaktionsbedingungen wurden nachfolgend auf Mikroarray-Versuche übertragen. Auch für dieses heterogene System mit festphasengebundener Sonden-DNA konnte eine Verkürzung der Hybridisierungsdauer mit p53 gezeigt werden. Bereits nach 30-minütiger Inkubation wurden deutliche Hybridisierungssignale nachgewiesen. Gegenüber Hybridisierungsversuchen mit reinem Puffer, ist dies ein deutlicher Zeitgewinn. Um den Bedarf an p53 nachfolgender Arrayexperimente decken zu können, wurden initiale Klonierungs- und Expressionsversuche in E.coli durchgeführt.Item Open Access Bakteriochlorophyllvorstufen und Pigment-Protein-Komplexe in Rhodospirillum rubrum ST3 und GN11(2006) Hammel, Jörg U.In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Mutanten des Alpha-Proteobakteriums Rhodospirillum rubrum untersucht, die im Bakteriochlorophyll-Biosyntheseweg unterbrochen sind, um einen Beitrag zum genaueren Verständnis der Biosynthese dieser Moleküle und der einzelnen daran beteiligten Schritte zu liefern. Von den beiden Stämmen ST3 und GN11 wurden die ins Kulturmedium ausgeschiedenen Pigmente aufgereinigt und spektroskopisch analysiert. Ebenfalls wurden sowohl von ST3, als auch von GN11 die in intracytoplasmatischen Membranen gebundenen Pigmente extrahiert und aufgereinigt. Anhand der ermittelten spektroskopischen und chromatographischen Eigenschaften der isolierten Pigmente konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei denen ins Kulturmedium ausgeschiedenen und in intracytoplasmatischen Membranen gebundenen Pigmenten um dieselben Bakteriochlorophyllvorstufen handelt. Die im ST3-Stamm angehäuften Vorstufen P660 und P667 (benannt nach dem langwelligsten Absorptionsmaximum) konnten als 2-Devinyl-2-alpha-hydroxyethyl-phaeophorbid a und Phaeophorbid a bestimmt werden. Bei denen im GN11-Stamm angehäuften Vorstufen handelt es sich um ein Gemisch verschiedener Vorstufen in dem mit Sicherheit Magnesium 2,4-Divinylphaeoporphyrin a5 Monomethylester als eine Komponente enthalten ist. Von beiden Stämmen wurden Pigment-Proteinkomplexe aus intracytoplasmatischen Membranen isoliert. Die gewonnen Pigment-Proteinkomplexe zeigen Absorptionsspektren, die in Übereinstimmung sind mit Spektren ganzer Zellen und in beiden Fällen ein deutliches CD-Signal aufweisen. Die Komplexe enthalten neun Proteine unterschiedlicher Größe, für die keine eindeutige Zuordnung getroffen werden konnte. Elektronenmikroskopische Aufnahmen der isolierten Pigment-Proteinkomplexe vom ST3-Stamm zeigen partikuläre, ringförmige Strukturen. Sie neigen zur Aggregation und bilden unter diesen Umständen fädige und runde Formen aus.