04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Construction of robust Escherichia coli strains for large-scale production(2022) Ziegler, Martin; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)The biotechnical production of many fine chemicals, proteins or pharmaceuticals depends on large-scale microbial cultivations. Due to limited mixing, heterogeneities in process relevant parameters such as nutrient concentrations arise in such fermentations. Escherichia coli (E. coli) is a model organism frequently used in the biotechnological industry. If E. coli is cultivated under heterogeneous conditions, biological reactions of the microorganism result in reduced process performance. Since large-scale fermentations are not economically feasible in academic settings, scale-down reactors that mimic aforementioned heterogeneities are used to investigate heterogenous fermentations. Previous studies in scale-down reactors unraveled that, depending on the process strategy, the unstable supply of a limiting primary carbon or nitrogen source such as glucose or ammonium is one of the underlying causes of process performance loss. Low concentrations of glucose or ammonium elicit the stringent response as a biological starvation reaction which comprises extensive transcriptional reactions. In the first project that contributes to this thesis, the regulatory and transcriptional reactions of the strains E. coli MG1655 and E. coli SR to repeated exposure to ammonium starvation zones were examined in a scale-down reactor. The scale-down reactor followed a two-compartment approach and consisted of a stirred tank reactor and a plug-flow reactor simulating passage through a starvation zone. E. coli SR is a strain with modulated stringent response. It was observed that short-term starvation stimuli do not trigger this regulatory program in E. coli SR and the transcriptional reaction was noticeably reduced. Long-term adaptation of the strain to repeated cycles of limitation and starvation also clearly differed from E. coli MG1655. Despite lack of the stringent response, E. coli SR showed no deficits in the assimilation of the limiting ammonium or in biomass yield on ammonium. In the second project of this thesis, a series of deletion strains with robust phenotype against glucose starvation zones were constructed. Candidate genes were identified and successively removed from the genome of E. coli MG1655 by Recombineering. The fundamental growth parameters of the strains were determined in shaking flask fermentations and no noticeable differences compared to E. coli MG1655 were found. Chemostat cultivations in a scale-down reactor with glucose as the limiting nutrient source revealed that the final strain of the deletion series, E. coli RM214, had a significantly lower maintenance coefficient under heterogeneous conditions than E. coli MG1655. Moreover, in an exemplary heterologous protein productionscenario E. coli RM214 rhaB- pJOE4056.2_tetA proved to be more robust to heterogeneities and showed a significantly higher product yield than E. coli MG1655 rhaB- pJOE4056.2_tetA. In the third project of this thesis, the production of pyruvate in E. coli MG1655 by inhibition of pyruvate dehydrogenase through CRISPR interference was investigated. A central goal was to achieve the stable production in nitrogen-limited conditions. For this, different target sequences in the operon pdhR-aceEF-lpd were tested and the strains cultivated in shaking flask fermentations. All tested target sequences were generally suitable to trigger the accumulation of pyruvate. Combined CRISPR interference against two target sequences did not lead to an increased pyruvate yield in most cases. In addition, the strains E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 and E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 were characterized in two phase fermentations in lab-scale reactors. The initial phase was an unlimited exponential growth phase and was followed by an ammonium-limited production phase. E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 only produced pyruvate during the exponential phase, and reuptake of pyruvate occurred in the second phase. In contrast, E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 stably produced pyruvate during the exponential and the ammonium-limited phase and is a potential chassis strain for the growth-decoupled production of pyruvate derived bioproducts. The overarching research issues of the projects were the characterization of strains in heterogeneous conditions and the development of new strategies to improve their performance. The collected data leads me to conclude that the construction of robust microbial strains for large-scale applications is both expedient and feasible. Tailored genetic modifications are the method of choice to achieve this goal. Furthermore, suitable genetic constructs offer promising possibilities for the stable growth-decoupled production of chemicals in nitrogen-limited conditions.Item Open Access Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenasen und Prozessentwicklung der enzymatischen Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol(2008) Samorski, Markus; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)Für die enzymatische Dehalogenierung von 1,2,3-Trichlorpropan zu optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol wurden im Rahmen dieser Arbeit die kovalente Immobilisierung mit dem Enzymträger Eupergit modelliert, die enzymkinetische Charakterisierung der eingesetzten Haloalkan-Dehalogenasen durchgeführt, ein detailliertes Festbettreaktormodell erarbeitet, eine vollautomatisierte Versuchsanlage zur Modellvalidierung und Prozessoptimierung entworfen, gebaut und betrieben, das Langzeitaktivitätsverhalten der beiden Haloalkan-Dehalogenasen untersucht sowie eine Bewertung der eingesetzten Immobilisierungsmethoden vorgenommen. Die Eupergit-Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenase DhaA wurde durch ein kinetisches Modell beschrieben, das aufgrund der Abwesenheit diffusiver Limitierungen die Phänomene Inaktivierung des löslichen Enzyms und Immobilisierungsreaktion in einphasiger Weise beschreibt und einer analytischen Lösung zugänglich ist. Die experimentelle Überprüfung offenbarte eine ausreichende Vorhersagegüte des Modells. Aufgrund der stärkeren thermischen Aktivierung der Immobilisierungsreaktion gegenüber der Enzyminaktivierung führt eine Absenkung der Immobilisierungstemperatur zu sowohl geringeren Enzym-Ausbeuten als auch niedrigeren Raum-Zeit-Ausbeuten der Immobilisierung. Die Ausbeute an aktiv immobilisiertem Enzym kann durch den Einsatz hoher Eupergit-Konzentrationen gesteigert werden. Der Einfluss der Eupergit-Konzentrationen bei der Immobilisierung auf die Reaktorgröße des Syntheseprozesses konnte quantifiziert werden. Die enzymkinetische Beschreibung der Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4, die durch eine Michaelis-Menten-Kinetik mit kompetitiver Produktinhibierung sowohl temperatur- als auch pH-abhängig vorgenommen wurde, konnte die unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften der Enzyme offen legen. Haloalkan-Dehalogenase DhaA zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Substrat und Produkt der betrachteten Dehalogenierung aus (K_M(30°C, pH 9) = 1,79 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 1,56 mmol/l), während das Enzym DSD4 sowohl eine geringere Substrat- als auch Produktaffinität aufweist (K_M(30°C, pH 9) = 9,96 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 25,6 mmol/l). Auf Basis der kinetischen Daten konnte ein Festbettreaktor als der ideale Reaktortyp für die enzymatische Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol identifiziert werden. Zur Beschreibung des Festbettreaktors wurde ein detailliertes Modell entwickelt, das zwei Kompartimente unterscheidet und die Phänomene Konvektion, Dispersion, Stofftransport, Diffusion, Adsorption und Reaktion berücksichtigt. Die benötigten Parameterwerte wurden teilweise experimentell bestimmt oder empirischen Korrelationen aus der wissenschaftlichen Literatur entnommen. Das zur Erzielung höherer Produktkonzentrationen erarbeitete Konzept eines Rückführungsprozesses wurde ebenfalls adäquat modelliert. Miniplant-Experimente der immobilisierten Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4 zeigten eine gute Übereinstimmung der experimentellen Beobachtungen und den Simulationsergebnissen. Die Konzentrationsprofile im Festbettreaktor von Fließgleichgewichtsexperimenten werden in erster Linie von den enzymkinetischen Parametern bestimmt, während das dynamische Reaktorverhalten nach einer sprunghaften Änderung der Zulaufbedingungen erheblich von der Substrat- und Produktadsorption am Enzymträger abhängt. Bei den experimentellen Beobachtungen der Prozessvariante mit Rückführung wurde eine Nebenproduktbildung beobachtet, die die Prozessbeschreibung durch das Modell aufgrund zusätzlich verbrauchter Lauge erschwert. Im Falle geringer Nebenproduktbildung kann die Abweichung toleriert und die Vorhersage der zeitlichen Konzentrationsverläufe durch das Modell als ausreichend bezeichnet werden. Die erzielte Raum-Zeit-Ausbeute des Prozesses mit Rückführung entspricht in etwa der des kontinuierlich betriebenen Festbettreaktors bei gleichem Umsatz.Item Open Access Modellgestützte Entwicklung eines Prozesses für die mikrobielle Hydrolyse von Propionitril zu Ammoniumpropionat(2000) Christian, Hans Jürgen; Syldatk, Christoph (Prof. Dr. rer. nat.)Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand in der Entwicklung der Grundlagen für einen Prozeß zur mikrobiellen Hydrolyse von Propionitril zu Ammoniumpropionat. Zu Beginn der Arbeit wurde der verwendete Mikroorganismus auf seine Gattungszugehörigkeit hin untersucht und als Patentstamm Rhodococcus erythropolis DSM 13002 bei der DSMZ hinterlegt. Zur Bereitstellung einer geeigneten Menge an homogener Biomasse wurde der Stamm in einem Maßstab von 70 l im Bioreaktor kultiviert. In weiteren Untersuchungen erfolgte dann eine Optimierung des Wachstumsmediums. Die Untersuchung der nitrilverseifenden Eigenschaften ergab, daß in dem untersuchten Stamm ein Zwei-Enzym-System aus einer eisenabhängigen Nitrilhydratase und einer Amidase vorlag. Diese wurden auf ihre biochemischen Eigenschaften im Ganzzellsystem hin untersucht. Durch Immobilisierung der Zellen konnte die Toleranz des Biokatalysators gegenüber dem Substrat Propionitril deutlich verbessert und bei einer absatzweisen Prozeßführung Nitrilkonzentrationen bis über 1 M umgesetzt werden. Bei der Untersuchung des Einflusses der Immobilisierung auf die Aktivität wurde eine moderate innere und äußere Stofftransportlimitierung bestimmt. Der Biokatalysator wurde als Immobilisat in absatzweiser Prozeßführung mit konstanter Substratzugabe (Fed-batch), im kontinuierlichen Rührreaktor sowie im Festbett eingesetzt. Dabei konnten im Fed-batch Prozeß Produktkonzentrationen von bis zu 3 M Ammoniumpropionat erhalten werden. In dieser Arbeit wurde ein Reaktionsmodell für das Zwei-Enzym-System erstellt. Anschließend wurden sämtliche Modellparameter über Anfangsreaktionsraten und mittels dynamischer Simulation in Verbindung mit nichtlinearer Regression bestimmt. Eine Anwendbarkeit der reaktionskinetischen Ansätze unter dynamischen Bedingungen wurde anhand eines Fed-batch-Prozesses überprüft und eine gute Übereinstimmung der simulierten Konzentrationsverläufe mit den Meßdaten ermittelt.Item Open Access Modellgestützte Entwicklung eines mehrstufigen Verfahrens zur enzymatischen Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren(2008) Teves, Harald; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vollständigen Verfahrens zur Synthese von enantiomerenreinen L-Aminosäuren durch Biotransformation mit immobilisierten Enzymen. Als Modellsystem wurde die zweistufige Hydrolyse von D,L-Benzylhydantoin über L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin gewählt. Die erste Stufe wurde durch das enantioselektive Enzym Hydantoinase katalysiert und die zweite durch das enantiospezifische Enzym L-Carbamoylase. Ein Schwerpunkt war die Analyse und Modellierung des gegebenen Reaktionssystems, das die reversible Reaktion von D- bzw. L-Benzylhydantoin zu D- und L-Caramoylphenylalanin, die irreversible Reaktion von L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin sowie die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin umfasste. Die Parameter in den enzymkinetischen Gleichungen wurden aus Anfangsreaktionsraten und zeitlichen Konzentrationsverläufen abgeschätzt. Da in einer Versuchsanlage an poröse Partikel immobilisierte Enzyme Verwendung fanden, wurden die enzymkinetischen Modelle um Gleichungen für den externen Transport der Reaktanten an die Partikeloberfläche und den internen Transport in den Partikeln erweitert. Die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin wurde mit zwei Modellen beschrieben, die sich in ihrem Detaillierungsgrad unterschieden. Während das erste Modell die Dissoziation des Benzylhydantoins berücksichtigte und die basenkatalysierte Racemisierung in wässriger Lösung von der Racemisierung an einem Ionenaustauscher differenzierte, vereinigte das zweite Modell die verschiedenen Mechanismen zu einer reversiblen Reaktion mit Hin- und Rückreaktion jeweils pseudo-erster Ordnung. Wichtigstes Ergebnis des detaillierten Modells war die Beschleunigung der Racemisierung durch Verschiebung des pH-Werts, wobei der durch Katalyse am Ionenaustauscher erzielte Geschwindigkeitszuwachs im Vergleich zur spontanen Reaktion exponentiell anstieg. Auf der reaktionstechnischen Analyse bauten die Gestaltung einer Versuchsanlage im Labormaßstab und die Erstellung eines mathematischen Prozessmodells dieser Versuchsanlage auf. Mit Rücksicht auf die begrenzte Aktivität der Enzymimmobilisate und die geringe Löslichkeit des Benzylhydantoins wurde das Verfahren, welches drei Operationen umfasste, absatzweise betrieben: Auflösung von D,L-Benzylhydantoin in einem gerührten Membranreaktor, zweistufige enzymatische L-Phenylalanin Synthese in einem Festbettreaktor mit immobilisierter Hydantoinase und L-Carbamoylase sowie Racemisierung des nicht abreagierten Substrats D-Benzylhydantoin in einem zweiten mit starkem Anionenaustauscher gefüllten Festbettreaktor. Alle drei Apparate waren hintereinandergeschaltet und bildeten einen geschlossenen Kreislauf. Optional erfolgte eine nachgeschaltete Aufreinigung des Produkts L-Phenylalanin durch Elektrodialyse. Im Vorfeld zu den experimentellen Arbeiten an der Versuchsanlage - und später auch diese begleitend - wurde ein mathematisches Modell des gesamten Verfahrens erstellt und mit Versuchsdaten parametriert. Dieses Modell bildete die Auflösung von festem Benzylhydantoin in einem ideal durchmischten Membranreaktor, die enzymatische Umsetzung im ersten und anschließende Racemisierung im zweiten Festbettreaktor sowie die Rückführung in den Membranreaktor ab. Bezüglich der Festbettreaktoren wurden die Stoffbilanzen getrennt für das Hohlraumvolumen sowie die porösen Partikel der Schüttung aufgestellt. Verkoppelt waren sie durch den Stoffübergang an der Oberfläche eines jeden Partikels. In den porösen Partikeln katalysierten die an der inneren Oberfläche immobilisierten Enzyme die im vorangehenden beschriebenen Reaktionen. Es resultierten hauptsächlich partielle Differentialgleichungen, die mit einem finite Volumen Verfahren (TVD) örtlich diskretisiert und dem numerischen Integrator LIMEX gelöst wurden. Da die vollständige Umsetzung des racemischen Substrats D,L-Benzylhydantoin zum enantiomerenreinen Produkt L-Phenylalanin wesentlich von der Racemisierung abhing, kam dieser Umlagerungsreaktion eine zentrale Bedeutung zu. Es zeigte sich, dass eine Steigerung der Produktausbeute eine überproportionale Erhöhung der Ionenaustauschermasse erforderte. Andererseits bedeutete die Erhöhung der Ionenaustauschermasse einen zunehmenden Verlust an Produkt, da es durch Bindung an den Ionenaustauscher in der Reaktionslösung abgereichert wurde. Bezüglich des theoretisch möglichen Enantiomerenüberschusses von 100 % bei vollständiger Umsetzung des racemischen Substrats erwies sich beim gegebenen pH-Wert auch mit maximaler Racemisierungsgeschwindigkeit die langsame Rückreaktion von D-Carbamoylphenylalanin zu D-Benzylhydantoin als limitierend, und es resultierte ein maximaler Enantiomerenüberschuss von 64 %. Simulationsergebnisse belegten den vernachlässigbaren Einfluss der Auflösungskinetik des Benzylhydantoins auf das Gesamtgeschehen.Item Open Access Dynamische Modellierung und Simulation des Arzneimittelmetabolismus in humanen Leberzellen: Identifizierbarkeit, Robustheit und inter-individuelle Variabilität(2011) Bucher, Joachim; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)Die Effizienz in der heutigen Arzneimittelforschung und -entwicklung ist, bezogen auf das Verhältnis zwischen der Anzahl der potentiellen aktiven Wirkstoffe und der Anzahl der auf dem Markt vertriebenen Arzneimittel sehr niedrig. Diese Ineffizienz beruht darauf, dass mehr als die Hälfte der Wirkstoffe die klinischen Tests nicht besteht, was wiederum auf erhebliche toxische oder geringe pharmakokinetische Eigenschaften zurückzuführen ist. Untersuchungen zum Arzneimittelmetabolismus im Körper spielen eine große Rolle, da Arzneimittel toxische Eigenschaften annehmen können, wenn sie nicht effizient metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden. Die Leber trägt am meisten zum Arzneimittelmetabolismus bei, da Detoxifikationsenzyme, wie die Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYPs) und UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs), in großer Menge in den Leberzellen exprimiert sind und eine hohe inter-individuelle Variabilität aufweisen. Diese Variabilität darf jedoch nicht mit dem therapeutischen Fenster in Konflikt geraten. Daher erfordert diese inter-individuelle Variabilität eine breit gefächerte, auf Populations-Statistiken beruhende Risiko-Abschätzung der Toxizität in der pharmakologischen Forschung. Diese Arbeit, welche sich auf die dynamische Analyse des Arzneimittelmetabolismus in Hepatozyten konzentriert, setzt den Fokus auf die Modellierung des Netzwerkes in Phase I, II und III, in der Modellidentifikation anhand experimenteller Daten auf die Analyse der Parameter-Identifizierbarkeit, welche mit der Robustheit des Systems verknüpft ist, sowie auf die Vorhersage des individuellen Arzneimittelabbaus auf Basis von individuellen CYP- und UGT-Proteindaten. Die Untersuchung des Arzneimittelmetabolismus in dieser Arbeit zeigte, dass Modellierung und Simulation des Metabolismus und der Transportschritte in Leberzellen essentielle Elemente in der Vorhersage der Toxizität darstellen. Von Bedeutende sind vor allem die quantitative Bestimmung der Modellparameter, sowie die qualitative Beurteilung der Parameteridentifizierbarkeit anhand von Sensitivitäten und Korrelationen. Nur eine hochwertige Modellierung erlaubt die Vorhersage der pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneimittels in der Leber, die Prognose des inter-individuellen Ausmaßes und die statistische Analyse in der Bevölkerung. Diese Arbeit zeigte jedoch, dass dieses Isoenzym-System auf Basis von experimentellen Daten an hepatischen Mikrosomen kaum identifizierbar ist, da dieses System insensitive und nicht-identifizierbare Parameter aufweist. Daher zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die detaillierte Untersuchung des Reaktionsnetzwerkes an rekombinanten Isoenzymen vielversprechender und bedeutender ist als an Mikrosomen, in dem Fall, dass mehrere Isoenzyme an dem Abbau eines Arzneimittels zu einem bestimmten Produkt beteiligt sind. Des Weiteren spielen Transportschritte eine wichtige Rolle in der Elimination und der Ausscheidung von Arzneimitteln aus den Leberzellen. Die Modellidentifikation anhand experimenteller Daten an primären humanen Hepatozyten zeigte in ähnlicher Weise zu der Modellverifikation an Lebermikrosomen insensitive und linear korrelierende Parameter in den Transportschritten. Eine Möglichkeit der Modellreduktion auf Basis einer lokalen Parametersensitivitätsanalyse konnte in dieser Arbeit erfolgreich aufgezeigt werden, welche zu sensitiven Parametern führte und damit zuverlässige Modellvorhersagen zulässt. Die Modellverifikation sollte jedoch in Zukunft durch die Implementierung von zusätzlichen Daten aus Untersuchungen an rekombinanten Transportsystemen ergänzt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Vorhersage der inter-individuellen Variabilität auf quantitativen Proteindaten beruht, sollten die zukünftige Verbesserung der quantitativen Bestimmung der CYP- und UGT-Enzyme, sowie die entsprechende Entwicklung von Methoden für die Transportproteine weiter verfolgt werden. Zukünftig sollte ebenso ein Fokus auf die Kopplung des Moduls des Arzneimittelmetabolismus mit den Modulen Zentralmetabolismus und Genregulation gelegt werden, was die holistische Simulation des Arzneimittelmetabolismus in Wechselwirkung mit den anderen Prozessen in der Zelle unter normalen und krankheitsbedingt gestörten Bedingungen erlaubt. Die Vorhersage der Reaktionswege, der Enzympartner und sogar der Modellparameter, sowie deren Verteilung in der Bevölkerung auf Basis von physikochemischen Eigenschaften von Substanzen, wird ebenso eine zentrale Rolle in der Zukunft spielen. Ein weiteres Potential des in dieser Arbeit vorgestellten Modellierungsansatzes liegt in der Implementierung in multi-kompartimentellen physiologisch basierten pharmakokinetischen Modellen. In diesem Rahmen könnten die individuellen in-silico-Vorhersagen verbessert und ein weiterer Fortschritt in der Entwicklung der personalisierten Medizin erreicht werden.Item Open Access Expressionsoptimierung und Produktion von Haloalkan-Dehalogenasen zur Umsetzung von 1,2,3-Trichlorpropan(2007) Fritz, Christina; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h. c. )Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Haloalkan Dehalogena-sen zur biokatalytischen Umsetzung des prochiralen 1,2,3 Trichlorpropan zu dem (R) oder (S) Enantiomer des 2,3-Dichlor-1-propanol. Die Bereitstellung dieser En-zyme schließt sowohl eine Optimierung der heterologen Proteinexpression im jewei-ligen Wirtsorganismus, als auch die Produktion und Aufreinigung des Biokatalysa-tors ein. Die von der Firma DOW Chemicals bereitgestellten Haloalkan Dehalogenasen un-terscheiden sich im Wesentlichen hinsichtlich ihrer ee-Werte bezüglich des Produkts 2,3-Dichlor-1-propanol und im Hinblick auf ihr Expressionsverhaltens in Escherichia coli. Für die aus einem Bodenscreening stammenden Haloalkan Dehalogenasen DSD4 und DSD49 wird auf Grundlage von experimentellen Ansätzen das intrazellu-läre Expressionsniveau dieser Proteine signifikant erhöht. Weiterhin werden auf Grundlage von modellgestützen Ansätzen Ursachen für die Bildung von "Inclusion bodies" während der heterologen Expression dieser Haloalkan Dehalogenasen her-ausgearbeitet. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der fermentativen Produktion von Ha-loalkan Dehalogenasen in E. coli über eine Hochzelldichte- Kultivierung im 30 l Maßstab und dem anschließenden Downstream-Prozess der Biokatalysatoren. Das Ziel dieses Arbeitsschwerpunkts liegt darin, den Biokatalysator im halbtechnischen Maßstab möglichst kostengünstig und innerhalb kurzer Zeit herzustellen. Für die Etablierung des Gesamtprozesses wird eine Haloalkan Dehalogenase aus Rhodo-coccus rhodochrous (DhaA) eingesetzt. DhaA weist gegenüber den DSD Varianten bezüglich des Produkts eine geringere Enantioselektivität auf, zeichnet sich aber bereits zu Beginn der Arbeit durch ein hohes Expressionsniveau in dem Wirtsorga-nismus E. coli aus. Innerhalb des Downstream- Prozesses wird die "High Gradient Magnetic Fishing"-Technik eingesetzt. Dieses Verfahren ermöglicht, wesentliche Schritte eines klassischen Chromatographie-Aufreinigungsverfahrens zu umgehen, was zu einer Kosten- und Zeitersparnis führt. Mit Hilfe der Magnettrenntechnik lässt sich der Downstream-Prozess für Haloalkan Dehlogenasen auf die drei Arbeits-schritte des Zellaufschlusses, der Affinitätsaufreinigung mittels HGMF und der Kon-ditionierung des Biokatalysators über eine Ultrafiltration reduzieren.Item Open Access CFD-Simulationen von Mischvorgaengen und biotechnischen Stoffumsetzungen in begasten Rührkesselreaktoren(2001) Schmalzriedt, Sven; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)Rührkesselreaktoren kommen in zahlreichen chemischen und biotechnischen Produktionsprozessen zur Anwendung, für biotechnische Stoffumwandlungen sind sie sogar der wichtigste Standardapparat. Die Methoden der numerischen Strömungssimulation (Computational Fluid Dynamics, CFD) liefern heute die Grundlage für detaillierte Untersuchungen der lokalen und zeitabhängigen Vorgänge bei Stoffumsetzungen in der turbulenten Zweiphasenströmung im Rührkesselreaktor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zum Einsatz von CFD-Simulationen bei der Analyse und Vorausberechnung biotechnischer Stoffumsetzungen in Rührkesselreaktoren entwickelt und auf exemplarische biotechnische Stoffumsetzungen angewendet. Bei der Modellierung wurde ein Mittelweg zwischen Komplexität und praktischer Anwendbarkeit gewählt, der auf der Entkopplung der Simulation von Fluiddynamik und Stoffumsetzungen beruht. Dadurch wurde die dynamische Simulation der Stoffbilanzen auf stationären Strömungsfeldern ermöglicht. Zunächst wurde das Durchmischungsverhalten in verschiedenen Reaktorkonfigurationen mit Einfach- und Mehrfachrührern anhand der Simulation von Pulsexperimenten untersucht. Simulationen der während der aeroben Fermentation von Saccharomyces cerevisiae auftretenden Substratverteilungen zeigen exemplarisch den erheblichen Einfluss der Konzentrationsgradienten auf das Ergebnis von im Zulaufverfahren durchgeführten Bioprozessen. Als Einflussfaktoren wurden die Rührerkombination im Mehrfachrührersystem sowie Rührerdrehzahl und Belüftungsrate betrachtet, wobei insbesondere die Wahl einer geeigneten Rührerkombination entscheidend ist. Es wird gezeigt, wie die unerwünschte Nebenproduktbildung durch die Berechnung eines optimalen Zulaufortes des Substrats minimiert werden kann. Zusätzlich wurden auf der Basis zweiphasiger, mit einem algebraic-slip-Ansatz berechneter Strömungsfelder die zugehörigen Verteilungen der Gelöstsauerstoffkonzentration simuliert.Item Open Access Untersuchungen zur Substratspezifität und Enantioselektivität mikrobieller Hydantoinasen(2000) Waniek, Thomas; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745. Für die Standardumsetzung von 5-Benzylhydantoin wurden die spezifische Aktivität und die Enantioselektivität ermittelt und mit anderen Hydantoinen bzw. hydantoinanalogen Substanzen verglichen. Die Enantioselektivität der Umsetzung von 5-Benzylhydantoin zeigte weder eine Abhängigkeit von der Temperatur noch vom pH-Wert. Bei Hydantoinen mit Ethylgruppen wie 5-(Methylthioethyl)-hydantoin und 5-(Phenylethyl)-hydantoin konnte für diese Hydantoinase eine Umkehrung der Enantioselektivität festgestellt werden. Der gleiche Effekt konnte beim Austausch der Phenyl- gegen eine Trimethylsilygruppe gefunden werden. 5-(Trimethylsilyl)-hydantoin wurde D-spezifisch mit einer Enantioselektivität von E > 100 umgesetzt. Um den Einfluß einzelner Strukturelemente im Hydantoinring zu untersuchen, wurden verschiedene Hydantoinanaloga synthetisiert. 5-Benzyl-1,3-oxazolidin-2,4-dion, welches ein Sauerstoffatom anstelle der 1-NH-Gruppe besitzt, wurde von der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 mit einer geringen Aktivität D-selektiv zu Carbamoylphenylmilchsäure umgesetzt. Benzylsuccinimid, welches eine Methylengruppe anstelle der 1-NH Gruppe trägt, wurde mit einer sehr geringen Aktivität zu D-3-Benzylbernsteinsäurehalbamid umgesetzt. 3-substituierte Hydantoinanaloga wurden nicht als Substrate akzeptiert. Benzylbernsteinsäurehalbamid zeigte auf Umsetzungen mit der Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3745 einen starken inhibitorischen Einfluß (Ki = 0.34 mM). Umsetzungen mit weiteren Hydantoinasen aus Bacillus thermoglucosidasius, Thermus species (beides rekombinante Enzyme aus Escherichia coli) und aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 verliefen ausschließlich D-selektiv oder D-spezifisch. Alle Hydantoinanaloga wurden an derselben Position hydrolysiert wie das unveränderte Hydantoin.Item Open Access Resolving heterogeneities in single and multiphase bioreactor systems - Predictive modelling tools towards successful scale-up(2020) Kuschel, Maike; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Subzelluläre Metabolit-Analyse in Säugerzellen : Methodenentwicklung und Anwendung zur Untersuchung des Stoffwechsels von CHO-Zellen(2017) Matuszczyk, Jens-Christoph; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)