04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Integrated process design and optimisation for the production of cellobiose lipids from Ustilago sp.(2024) Oraby, Amira; Rupp, Steffen (Prof. Dr.)Item Open Access Etablierung einer biologischen vaskularisierten Matrix als Grundlage für ein in-vitro-Lebertestsystem(2007) Schanz, Johanna Elisabeth; Brunner, Herwig (Prof. Dr. techn.)Die Leber spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel eines Organismus. Sie ist aus einer Vielzahl hochspezialisierter Zellen aufgebaut und übernimmt komplexe, für den gesamten Organismus lebensnotwendige Stoffwechselfunktionen. Eingenommene Medikamente und Substanzen gelangen im Menschen über das Blutkreislaufsystem zur Leber und werden dort von den Hepatozyten um- und abgebaut (Biotransformation). Hierbei entstehen sogenannte Metabolite, die oft eine ganz andere (mitunter toxische) Wirkung haben als das ursprüngliche Medikament. Aus diesem Grund sind Leberzellen (Hepatozyten) bzw. das gesamte Organ "Leber" von besonderem Interesse als Analysesystem für Substanzen, Wirkstoffe und ihre Metabolite. Es gibt für Metabolismusstudien verschiedene, relativ einfache in vitro Testsysteme jedoch noch kein humanes organähnliches Lebermodell, das Langzeitstudien an primären Hepatozyten ohne Funktionsverlust ermöglicht. Damit isolierte Hepatozyten in der Kultur ihre Funktionalität behalten, ist die Bereitstellung einer möglichst in vivo ähnlichen Mikroumgebung wichtig. Dazu gehören einerseits die Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Leberzellen und andererseits die Gewährleistung der Zellversorgung sowie eine geeignete Trägerstruktur (Matrix), die eine 3-Dimensionalität der Kultur schafft. Zur Aufbau eines Co-Kultursystems wurden in dieser Arbeit Endothelzellen eingesetzt, da sie eine Filtrationsbarriere für Makromoleküle zwischen dem Blut und den Gewebszellen bilden und an der Regenerationsprozessen beteiligt sind. Als Trägerstruktur wurde eine azellularisierte, vaskularisierte Matrix aus Schweinedarm, das so genannte "Biological Vascularized Scaffold" (BioVaSc), verwendet. Sie basiert auf einem 10 - 15 cm langen Stück porcinen Jejunums, welches sich unter Erhalt der Gefäßsystemstrukturen inklusive des arteriellen Zuflusses sowie des venösen Abflusses chemisch azellularisieren lässt. Eine ausreichende Versorgung der Hepatozyten mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Abtransport von Toxinen und Metaboliten nach Medikamenten-/Wirkstoff-Umsetzung ließen sich durch ein computergesteuertes Bioreaktorsystem gewährleisten. Zum Aufbau eines Lebermoduls wurde die BioVaSc in zwei Schritten mit Zellen besiedelt: Im ersten Schritt erfolgte die Rebesiedelung der Gefäßstrukturen mit primären mikrovaskulären Endothelzellen oder endothelialen Vorläufer über den arteriellen Zufluss. Im zweiten Besiedlungsschritt folgte die Besiedlung des Matrixlumens (ehemaliger Darm) mit primären Hepatozyten. Dazu wurden die Zellen in einer Kollagen-I-Suspension ins Matrixlumen pipettiert und selbiges an beiden Seiten mit Klemmen verschlossen. Das so entstandene Co-Kultursystem ließ sich über einen Zeitraum von 2-3 Wochen im Bioreaktor kultivieren. Eine Probenentnahme zur Überwachung der Zellfunktionen erfolgte wochentäglich. Nach Versuchsende fand eine Fixierung der BioVaSc für die Herstellung von Paraffinpräparaten statt. Anhand der Expression der endothelzellspezifischen Marker CD 31 und FLK-1 konnte im Rahmen dieser Arbeit die Differenzierung porciner Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane Endothelzellen ließen sich unter Erhalt der genannten Marker in das Gefäßsystem integrieren und waren der Ursprung für neu entstandene Blutgefäße (Neoangiogenese). Die ins System integrierten Hepatozyten exprimierten ebenfalls zellspezifische Marker (CKLP 34, Hepatocyte), bildeten wichtige Zell-Zellkontakte wie Tight Junctions und Adherens Junctions aus und proliferierten. Durch die Anfärbung von Tight Junctions ließen sich zwischen den Zellen Gallenkanälchenstrukturen sichtbar machen. Eine Kommunikation zwischen Endothelzellen und Hepatozyten (cellular Cross-Talk) konnte über die Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) belegt werden. Anhand der Mediumproben ließ sich nachgeweisen, dass die Hepatozyten bis zum Ende der Kultur Harnstoff sowie Albumin synthetisierten und Laktat bildeten. Der Phase-I- und Phase-II-Metabolismus von Dextrometorphan war im porcinen Modell ohne Enzyminduktion nachweisbar. Die Etablierung des Lebermoduls erfolgte zunächst aufgrund der besseren Verfügbarkeit auf Basis porciner Zellen. Die Ergebnisse ließen sich jedoch anschließend auf das humane Modell übertragen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die BioVaSc als Grundlage für ein Lebertestsystem eignet. Das hier aufgebaute System hat als erstes Modell ein Gefäßsystem zur Co-Kultur von Endothelzellen und Hepatozyten unter physiologischen Bedingungen. Erstmals stellt ein Lebermodell damit die Möglichkeit in Aussicht den Transport von im Blut gelösten Molekülen durch die sinusoidale Endothelzellschicht zu den Hepatozyten bzw. von Metaboliten durch die sinusoidale Endothelzellschicht zum Blut zu untersuchen.Item Open Access New insights into structure and function of type I collagen(2008) Xiong, Xin; Brunner, Herwig (Prof. Dr. techn.)Collagen is one of the most abundant proteins in mammalians and strongly conserved throughout evolution. It constitutes one third of the human proteome and comprises three-quarters of the dry weight of human skin. It is widely accepted as a major structural component in animal body such as in bones, cartilage and skins. More and more studies have shown that, in addition to the structural function, collagens can induce or regulate many cellular functions and processes such as cell differentiation, cell motion, cell communication and apoptosis. Furthermore, its unique triple helix structure gained more attention since it is responsible for its high stability and biological function. Due to the high accessibility, Type I and Type III collagen are widely studied and frequently used as biocompatible materials in cell culture, tissue engineering and medical technology. Until now the understanding of the molecular mechanisms for collagen assembly is of great medical and also biotechnological importance. Here, large amounts of highly purified homogeneous Type I collagen have been obtained from rat tail tendon by a simple two-step purification involving extraction with 9 M urea followed by Superose 12 chromatography. This simple two step purification of Type I collagen is up-scalable. The yield is up to 95%. The product could be easily lyophilized and stored. AFM and SEM images showed a structure similar to natural collagen. This collagen was extensively characterized by different biochemical, physical and cell biological methods. Mass spectrometry identified only collagen Type I peptides indicating that the extracted collagen was homogeneous. The comparison between urea-extracted (UC) collagen and acetic acid-extracted collagen (AC) showed significant differences whereby the UC was not degraded or hydrolyzed as in acetic acid. Furthermore, tandem MS analyses showed some interesting post-translational modifications, which will result in new insights into collagen structure in vivo. The purified collagen was renatured quantitatively by dialysis against water to form triple-helices, as judged by UV-circular dichroism. The collagen dissolved in 8M urea exhibits a unique reversible aggregation behavior which is not affected by the presence of reducing agents. UV-circular dichroism analysis shows that collagen initiates triple helix formation at 4 M urea or below. This triple helix structure is comparable to that observed with synthetic collagen peptides. Cultures of a 3T3 mouse embryonic fibroblast cells incubated with urea-extracted collagen showed a higher motility than those grown with acetic acid-extracted collagen as judged by light microscopy and scanning electron microscopy. The real time PCR showed significant difference on transcriptional level and showed clearly up regulation of the genes involved in response to mechanical stress in AC but not in UC and reference culture in medium. All these results indicate a benefit of UC for biotechnological/biomedical applications. The urea-extracted collagen exhibits a unique reversible-aggregational phenomenon during gel filtration in 8 M urea. We could show that covalent bonds and cross-linkings are not involved. This observation and subsequently extensive mass spectrometric analyses led to a new model of triple-helical assembly and a hypothesis about the collagen export, which may offer some new insights into understanding of collagen structure and transport from cytosol to extracellular space. The results presented here have led to an industrial patent (patented on 04. 30th. 2008). A manuscript was submitted to FEBS J for publication.Item Open Access Phänotypische und molekularbiologische Untersuchungen der Interaktionen in gemischten Biofilmen(2012) Purschke, Frauke Gina; Rupp, Steffen (PD Dr.)Die Mehrheit der Mikroorganismen lebt in ihrer natürlichen Umgebung in Biofilmen, oberflächenassoziierten Lebensgemeinschaften, die normalerweise von einer extra-zellulären Matrix umgeben sind. Die meisten Biofilme werden nicht von einzelnen sondern mehreren Spezies gebildet, die in den Biofilmen nicht nur miteinander kooperieren, sondern auch um vorhandene Nährstoffe konkurrieren. Die Gram-negative Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa und der polymorphe Pilz Candida albicans sind zwei opportunistisch Pathogene, die oft in Co-Existenz in einem humanen Wirt nachgewiesen werden. Verschiedene Modelle antagonistischen Verhaltens wurden für diese Organismen in gemischten Biofilmen berichtet. Um diese Inter-aktionen zwischen P. aeruginosa und C. albicans genauer zu erforschen, wurde der Einfluss der Quorum sensing Moleküle untersucht. Hierfür wurde ein in vitro Assay etabliert, der eine einfache und schnelle Detektion von Veränderungen in der Aus-prägung von Biofilmen erlaubt. Während sowohl Überstände als auch nur das für die Biofilmbildung von P. aeruginosa wichtige Quorum sensing Molekül N-3-oxo-dodecanoyl-homoserinlacton die Biofilmbildung von C. albicans unterdrücken, wirkt Farnesol, der Pilz-Autoinducer, zwar inhibierend auf die Adhärenz, aber verstärkend auf bereits bestehende bakterielle Biofilme. Zur weiteren Charakteriserung dieser Interaktion wurde das Sekretom einzelner und gemischter Biofilme zu verschiedenen Zeitpunkten mit MALDI-TOF MS/MS analysiert. Insgesamt wurden 247 unter-schiedliche Proteine identifiziert, von denen 170 P. aeruginosa und 77 C. albicans zugeordnet werden konnten. P. aeruginosa sekretierte in Anwesenheit von C. albicans Virulenzfaktoren wie das Exotoxin A sowie Proteine der Stoffwechselwege zur Eisenerfassung wie das Pyochelin-Biosynthese-Protein PchD und den Ferripyoverdin-Rezeptor FpvA. Außerdem wurde in gemischten Biofilmen jedoch nicht in rein bakteriellen Biofilmen das Siderophor Pyoverdin identifiziert, das Eisen mit großer Affinität bindet. Dieses deutet darauf hin, dass P. aeruginosa in Konkurrenz mit C. albicans die Wege zur Eisenaufnahme induziert. Von C. albicans dagegen wird der Metabolismus reprimiert, inklusive der detektierten eisenbindenden Proteine. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mikroorganismen nicht nur mit dem Wirt um essentielle Nährstoffe konkurrieren, sondern auch mit der vorhandenen Mikroflora. Die transkriptionellen Veränderungen während der Ausbildung von Biofilmen wurden genutzt, um Reporterstämme in C. albicans, P. aeruginosa und dem nicht-pathogenen E. coli herzustellen, welche die Bildung von Biofilmen anzeigen. Mit Hilfe dieser Stämme können Quorum sensing Moleküle anderer Mikroorganismen detektiert werden. Gemeinsam mit dem in vitro Assay steht mit diesen Stämmen eine Toolbox zur Verfügung, um Biofilme und Einflüsse auf diese zu charakterisieren.Item Open Access Simulation of Electron Bernstein Waves in FLiPS with various numerical methods(2021) Rumiantsev, Kirill; Hirth, Thomas (Prof. Dr.)The plasma generation and heating by microwaves is an important research topic in the field of controlled nuclear fusion. All modern fusion plasma devices such as Wendelstein 7-X use microwave heating. The microwave plasma-heating primarily occurs at the resonances, where the microwaves are efficiently absorbed. The heating scenario must be designed such that the microwaves can reach the resonance. When the plasma exceeds the cutoff density, the microwaves will be reflected, and the resonance becomes inaccessible. However, it is possible to perform heating by Electron Bernstein Waves (EBWs), since these electrostatic waves propagate even in overdense plasmas, unlike the electromagnetic plasma waves. EBWs cannot propagate in the vacuum and must be created through a coupling process. Both O- and X-mode can couple to EBWs. The thesis investigates the coupling of the O- and X-mode to EBWs as well as the EBW propagation with various numerical methods. The application of only one numerical method is not sufficient as the coupling involves very different wavelength scales. The optimal coupling scheme for the expected plasma parameters was determined using a Finite-Difference Time-Domain (FDTD) code. Since EBWs are not included in the code, a Boundary-Value Problem (BVP) code was developed. Using the BVP code, the effect of the collisions on EBWs was studied. The field amplification at the upper-hybrid resonance (UHR), where EBWs couple to the electromagnetic waves, and the effect of the magnetic field on EBWs could be directly visualized. The propagation of the EBW was investigated using the novel ray-tracing code RiP. The ray-tracing simulations provided a clear picture of the essential features of the wave propagation. For the O- and X-mode coupling, the importance of the axial plasma inhomogeneity was shown. For the first time, the method of the Wigner function was applied to calculate the intensity distribution of EBWs. Both, ray-tracing and the Wigner function simulations showed that the inhomogeneous magnetic can cause focusing of EBWs. The focusing effect can have practical applications e.g. for controlled local heating of the plasma. Additionally, the focusing effect can cause a parametric decay due to the field enhancement in the focal regions. In this thesis, the simulations were focused on excitation and propagation of EBWs in the geometry of the linear plasma device FLiPS located at the University of Stuttgart. Measurements were carried out to study the predicted focusing of the EBWs in the FLiPS plasma with monopole antennas. The measurements provided the density profile used in the simulations. The expected amplification of the signal at the UHR was not detected, indicating either the complete collisional absorption of the X-mode at the upper-hybrid resonance, or the turbulent plasma density oscillations that reduce the coupling efficiency to EBWs. These effects can be studied further using the developed tools since they provide a complete toolbox to study the full coupling process to EBWs in an actual experimental geometry.Item Open Access Influence of the ion energy on generation and properties of thin barrier layers deposited in a microwave plasma process(2012) Ramisch, Evelyn Christine; Stroth, Ulrich (Prof. Dr.)The demand for environment-friendly energy sources increases more and more, which is not only caused by the energy turnaround initialized by the Federal Government. In this context, the focus is set mainly on the development of wind power and solar energy with competitive production costs. Above all, this is a problem for solar cells, which, today, are mainly fabricated out of crystalline silicon and, therefore, are in competition with semiconductor industry. Hence, the development of solar cells based on alternative materials like e.g. copper-indium-gallium-diselenide (CIGS) is of great interest. Because of the lower layer thickness needed for this material, these solar cells can be fabricated on flexible substrates like metal foils. This possibility offers a broader spectrum of applications. For reaching low production costs, the applicability of unpolished steel foil, which exhibits scratches on the µm scale, is investigated as substrate for the solar cells in this work. The use of any metal as substrate requires a barrier layer between the substrate and the solar cells to prevent short-circuits between the separate cells of a solar module and to prevent the diffusion of undesired substrate elements into the solar cells. In this work, siliconoxide and silicon-nitride coatings are deposited as barrier layers in a microwaveplasma process in a gas mixture of HMDSO (hexamethyldisiloxane) and oxygen or monosilane and ammonia. To have the opportunity of influencing the layer growth by high-energetic ions, an additional substrate bias is applied during the deposition, which leads to a capacitive discharge superimposing the microwave one. The high-energetic ions impinging on the layer surface lead to a layer smoothing and melting, especially at positions of indentations in the substrate surface. Hence, the barrier properties of the coating are improved clearly, which was identified by insulation measurements of the deposited film. The layer growth modification is analyzed on the basis of substrates with a well-defined rough surface structure in the µm range experimentally as well as by simulations with the Monte-Carlo Code SDTrimSP-2D, which allows a detailed analysis of the local layer growth mechanisms contributing to the deposition. Additionally, the impinge of the energetic ions affects the molecular structure and composition of the coatings as well. These parameters are an important indicator for the layer material properties like adhesion, hardness and diffusion properties. The molecular composition of the deposited layers is analyzed in detail by Fourier- ransform infrared (FTIR) spectroscopy. From the layer composition and their refractive index, conclusions on the diffusion behavior of the coatings are drawn. In case of applying the substrate bias, the spectra indicate a denser and harder film in case of silicon oxide. Hence, these layers are more diffusion preventing compared to the unbiased ones. On the other hand, the silicon-nitride coatings show contrary properties: They offer more porous layers, when the substrate bias is applied, and, therefore, they assist diffusion.Item Open Access Particle dynamics simulation and diagnostics of the PECVD processes in fluorocarbon rf discharges(2010) Barz, Jakob Philipp; Lunk, Achim (Prof. Dr. rer. nat. habil.)The present work deals with the investigation of fluorocarbon plasmas by different experimental methods and supporting numerical analysis of the plasma with an emphasis on plasma-chemical interactions. Several insights could be gained from the combined experimental and numerical approaches, especially concerning the conclusiveness of the results and previous observations from the literature. Plasma diagnostics were performed with non-invasive methods, such as UI probe measurements, microwave interferometry, laser-induced fluorescence, UV absorption measurements, and mass spectrometry. The complementary numerical simulations accounted for the electron-neutral interactions, discharge dynamics, and chemical reactions. From the excitation and ionization cross sections of argon as well as the dissociation, ionization, and attachment cross sections of trifluoromethane, the field-dependence of transport parameters were obtained. These transport parameters were used as input data for fluid-modeling of the discharge. For the plasma dynamics simulation, the Boltzmann-equation was solved numerically for transport of mass, momentum, and energy in a time-dependent two-term approach. The so-obtained electron density and the power-voltage characteristics were compared to measurements with microwave interferometry and the UI probe, respectively. An overall good agreement of the numerical and measured electron densities was obtained over a large variation range of plasma power, gas composition, and pressure. The power-voltage characteristics showed a good agreement between numerical results and data obtained right after ignition of plasma. It was further found that the measured data showed time-dependent developments from which strong deviations resulted. The time scales of changes were typically in the range of milliseconds to seconds after ignition. It was concluded that compositional changes in the gas phase were the reason. The high abundance of oligomers as well as small molecules like HF in the gas phase on one hand, and the loss of molecules by polymer deposition on the other hand affect the charge carrier mobilities and the ionic composition, such result in the changes observed. Furthermore, from this investigation, the major fragmentation processes were identified. For the investigation of the reaction-diffusion processes, investigations by laser-induced fluorescence were carried out. In order to obtain best resolution along the axial direction of the plasma reactor, the conventional crossed-beam technique was modified. Such, a resolution of up to 60 micrometers became possible. Thus, highly-resolved axial densities of two plasma abundant intermediates, fluoromethylidine and difluorocarbene, were obtained. For the analysis of the gas phase kinetics, a numerical chemical-diffusion model was set up. To complete the analysis of the plasma dynamics, the deposition of plasma polymer onto substrates was examined. The deposition rate was determined, and changes in the surface chemistry at the transition form uncovered substrates to closed films were revealed. For the identification of the deposition precursors, results from the chemical-diffusion model were adopted for the analysis. The oligomer molecules, which are produced at high results according to the simulation, were shown to correlate well with the polymer deposition rate. It was found by electron spin resonance (ESR) that chemical reactions took place within the deposited polymer films. The restructuring of the polymer by these reactions resulted in highly cross-linked films according to x-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Further, it was found that the amount of fluorine in the polymer was lower than could be expected from the oligomers formed according to the chemical model. Such, it was suggested that ejection of fluorine containing species was taking place especially during the plasma glow, promoted by electron and ion bombardment, and radiation. Moreover, the ejection of fluorine containing species was tentatively ascribed to the production of difluorocarbene at the surface of the plasma chamber as observed by LIF. Concluding, radical and metastable fluxes from the electrodes, combined with isotropic gas phase reactions, determine the density profiles of several species from trifluoromethane plasmas. They strongly feed back the plasma chemistry, which itself feeds back the plasma particle dynamics. According to models, the deposition occurs via formation of oligomers in the gas phase, which deposit on the surface either as neutrals or ions, and become crosslinked by subsequent reactions. The origin of the particle fluxes at the electrodes is not yet identified, but indications were found for the chemical cross-linking processes being the cause.Item Open Access Optimierung von überdimensionierten Hohlleiterkomponenten(2001) Plaum, Burkhard; Zohm, Hartmut (Prof. Dr. rer. nat.)Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Optimierung von überdimensionierten Hohlleiterkrümmern. Ziel einer solchen Optimierung ist ein möglichst niedriger Anteil der durch die Krümmung angeregten Falschmoden. Der Algorithmus kann auch zur Optimierung von schlangenartig gekrümmten Modenwandlern benutzt werden, mit denen die Eingangsmode vollständig in die Ausgangsmode gewandelt wird. Die Optimierung erfolgt durch Minimierung einer Bewertungsfunktion, die ein gewichteter Mittelwert aus der maximalen Falschmodenleistung innerhalb des Krümmers, der Falschmodenleistung am Krümmerausgang und der Ohmschen Verluste ist. Die Argumente der Bewertungsfunktion sind die Koeffizienten einer Reihenentwicklung (Fourier oder Tschebyscheff) der Krümmungsfunktion. Für die Optimierung wurden ein genetischer Algorithmus und ein Hybridverfahren aus Downhill Simplex und Simulated Annealing Algorithmus implementiert. Als ein Beispiel für eine Optimierung wird ein 28 GHz TE01-Krümmer vorgestellt. Der genetische Algorithmus lieferte hier einen Krümmer, bei dem der Falschmodenanteil im Inneren maximal 11.9 % beträgt. Am Ausgang haben die Falschmoden einen Anteil von 0.016 % der Gesamtleistung Ein Vergleich mit Krümmern, die bei gleichen Abmessungen herkömmliche analytische Krümmungsfunktionen haben, zeigt, daß der optimierte Krümmer in jeder Hinsicht besser ist. Der Krümmer wurde gefertigt und der geringe Falschmodenanteil am Ausgang wurde durch Messungen bestätigt. In einem weiteren Beispiel wurde ein 70 GHz TE01-HE11-Wandler optimiert, wobei als Startwert ein gerader Hohlleiter diente. Hier wurde eine Krümmungsfunktion gefunden, die, bei geringem Anteil höherer Moden, die TE01-Welle fast vollständig in eine HE11-Welle wandelt. Beide Verfahren liefern in mehreren Optimierungen reproduzierbare Ergebnisse. Das Downhill Simplex/Simulated Annealing Verfahren ist jedoch wesentlich schneller, als der genetische Algorithmus.Item Open Access Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans(2008) Hiller, Ekkehard; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.Item Open Access Entwicklung eines DNA-Microarrays zur Detektion von Resistenzdeterminanten in Acinetobacter baumannii(2014) Dally, Simon; Rupp, Steffen (PD Dr.)Acinetobacter baumannii ist ein opportunistisch pathogenes Bakterium, welches schwere Infektionen, insbesondere Pneumonie, Sepsis, Harnwegs- oder Wundinfekte, auslösen kann. Es besitzt die Fähigkeit, in beachtlichem Ausmaß, Antibiotika-Resistenzen zu akquirieren, was die Behandlung infizierter Patienten erheblich erschwert. Erst nach der Detektion dieser Resistenzen lässt sich eine gezielte antibiotische Therapie initiieren. In dieser Arbeit wurde ein DNA-Microarray entwickelt, der die Diagnose von Resistenzdeterminanten in A. baumannii ermöglicht. Der Zeitbedarf für die Arrayanalyse lag mit 4 Stunden dabei deutlich unter dem für konventionelle kulturbasierte Methoden. Der neu entworfene Microarray ist mit seinen 370 speziell entwickelten Sonden dazu in der Lage, 91 Zielsequenzen, die mit einer Antibiotika-Resistenz assoziiert sind, nachzuweisen. Die kurze Bearbeitungszeit, die für eine Analyse veranschlagt werden muss, gewährt die schnelle Verfügbarkeit therapierelevanter Resultate. Damit ist eine schnelle Anpassung der Medikation kritisch erkrankter Patienten und konsekutiv eine Verbesserung ihrer Prognose möglich. Auch zur Aufklärung epidemiologischer Fragestellungen könnte der Microarray eingesetzt werden.