04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Transformation von B. subtilis 168 : Optimierung und Regulation des Transkriptionsfaktors ComK(2017) Franzen, Regine; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)Item Open Access Das konservierte Zellproliferationsgen CDC123 kodiert für einen Initiationsfaktor der Translation: 2gamma-AP(2006) Richter, Frank; Seufert, Wolfgang (Prof. Dr.)Das Genprodukt von CDC123 in Saccharomyces cerevisiae ist essentiell und hochkonserviert. Es existieren Homologe in anderen niederen Eukaryonten ebenso wie in der Ackerschmalwand, dem Zebrafisch, der Maus oder auch dem Menschen. Ergebnisse zu dem orthologen Gen D123 aus einer Ratten-Fibroblastenzelllinie (3Y1) wurden erstmals 1984 publiziert. Es wurden konditionale Mutanten erzeugt, denen es bei restriktiver Temperatur nicht möglich war, in den Zellzyklus einzutreten und die DNA-Replikation zu initiieren. Das Interesse galt dabei der Identifikation neuer Regulatoren der Zellproliferation, um den Vorgang der Transformation hin zu unkontrolliert proliferierenden Zellen zu verstehen. Bei der Mutante 3Y1tsD123 konnte nach Inkubation bei restriktiver Temperatur ein Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Das mutierte Gen konnte kloniert und ein Nukleotidaustausch, der zu einem Aminosäureaustausch führte (A109V), nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen wiesen eine Proteasom-abhängige Instabilität dieses mutierten Proteins nach. Ebenso wurde eine teilweise granuläre Lokalisation von D123 im Cytoplasma und ein Kernausschluss beobachtet. Mögliche Phosphorylierungsstellen wurden ebenso beschrieben wie eine Homologie zu dem bis zum Beginn dieser Arbeit unbekannten ORF YLR215C in S. cerevisiae. YLR215C erhielt den Namen CDC123 in der Saccharomyces Genom Datenbank. In dieser Arbeit sollte CDC123 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht und eine molekulare Erklärung für die in Säugerzellen beobachteten Phänotypen gefunden werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Homologie von Cdc123 zu D123 nicht nur auf Sequenzebene existiert, sondern dass eine Deletion von CDC123 in Hefe durch das humane orthologe D123 komplementiert werden kann. Ebenso wie D123 in Säugerzellen ist auch Cdc123 in Hefe essentiell für den Eintritt in den Zellzyklus und das Verlassen der G1-Phase. Mit Hilfe der SGA-Analyse, der systematischen Suche nach synthetisch genetischen Interaktionen mit den ca. 4700 zur Verfügung stehenden Deletionen nicht essentieller Gene in S. cerevisiae, konnten 50 Gene identifiziert werden, die mit CDC123 in Verbindung stehen. Es waren Gene unterschiedlichster Bereiche zellulärer Funktion und Lokalisation dabei, die eine funktionale Einordnung von CDC123 allein aufgrund dieser Interaktionen unmöglich machte. Eine Gruppe von 6 Genen (GCN3, TIF1, TIF2, TIF3, TIF4631, TIF4632), allesamt Translationsinitiationsfaktoren, erschien vor dem Hintergrund einer publizierten Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 vielversprechend. Daraufhin konnte ebenfalls eine synthetische Interaktion (letal, bzw. krank) zwischen cdc123-Mutanten und GCD11- bzw. SUI2-Allelen (Untereinheiten gamma und alpha des Initiationsfaktors eIF2) gefunden werden. Interaktionsstudien mit verschiedenen an der Translationsinitiation beteiligten Faktoren zeigten, dass Cdc123 ausschließlich mit eIF2 interagiert, nicht aber mit dessen Nukleotidaustauschfaktor eIF2B oder eIF3, Teil des Multifaktorkomplexes (MFC) und des 43S Präinitiationskomplexes. Die Interaktion kann in einem von Ribosomen geklärten Überstand, frei von der 40S oder 60S ribosomalen Untereinheit, stattfinden. Zusammen deutet dies auf eine Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 in einem frühen Stadium der Translationsinitiation vor der Assoziation von eIF2 mit eIF3, d.h. dem MFC oder der 40S ribosomalen Untereinheit hin. Nach Inaktivierung von Cdc123-1 kann ein Verlust an Polysomen und eine Derepression der GCN4-Expression beobachtet werden. Sowohl das veränderte Polysomenprofil als auch die derepremierte GCN4-Expression sind Hinweise auf eine reduzierte Translationsinitiation. eIF2gamma wird, anders als die Untereinheiten alpha und beta, nach dem Verlust der Cdc123-Aktivität bei 25°C leicht und bei 37°C vermehrt instabil. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Abnahme der Gcd11-Menge nicht den primären Grund für die Wachstumsbeeinträchtigung der Cdc123-Mutanten darstellt. Vielmehr ist die Interaktion von eIF2gamma mit eIF2alpha und eIF2beta durch den Verlust der Cdc123-Aktivität stark reduziert. Dieser molekulare Befund wird als Ursache sowohl für den Arrest in der G1-Phase als auch für die reduzierte Translationsinitiation in Cdc123-Mutanten angesehen. In Übereinstimmung damit kann eine Deletion von CDC123, d.h. eine geringere Verfügbarkeit von eIF2 durch die Überexpression der Untereinheiten von eIF2 bedingt gerettet werden. Eine Überexpression der einzelnen Untereinheiten ermöglicht nur minimales Wachstum, wohingegen eine Kombination von eIF2gamma mit eIF2alpha oder aller drei Untereinheiten annähernd Wildtypwachstum zulässt. Cdc123 stellt somit einen neuen, für die Translationsinitiation essentiellen Faktor dar. Es ist notwendig für die effiziente Bereitstellung des eIF2-Komplexes, auf die möglicherweise über Cdc123 regulatorisch eingewirkt werden kann.Item Open Access Optimierung der Genexpression in Escherichia coli und Thermus thermophilus(2017) Wang, Lei; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Item Open Access Investigation of the interaction of PRMT6 and LEF1/β-catenin in hematopoiesis(2021) Schneider, Lucas; Lausen, Jörn (Prof. Dr.)Item Open Access Konstruktion von Escherichia coli Produktionsstämmen zur fermentativen Herstellung von Succinat aus Glycerin(2012) Söllner, Stefan; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Glycerin fällt in großen Mengen bei der Biodieselproduktion an und kann als billiger, nachwachsender Rohstoff betrachtet werden, aus dem sich biotechnologisch viele industriell relevante Fein- oder Bulkchemikalien herstellen lassen. Eine der Bulkchemikalien ist Succinat, das Anion der Bernsteinsäure, welche in Studien des Department of Energy der USA (DOE) in den Jahren 2004 und 2010 als wichtige Plattformchemikalie bezeichnet wurde. Plattformchemikalien bzw. chemische Bausteine können kostengünstig in eine Vielzahl von weiteren, höherpreisigen Materialien umgewandelt werden. In dieser Arbeit wurden Escherichia coli Produktionsstämme für Succinat konstruiert. Die Bildung größerer Zellmassen erfolgte vor der Produktionsphase in einer aeroben Wachstumsphase in Minimalmedium mit Glycerin als C-Quelle. In der mikroaeroben oder anaeroben Produktionsphase wurde dann wachstumsentkoppelt Succinat aus Glycerin und Kohlenstoffdioxid bzw. Hydrogencarbonat gebildet. Die Entstehung von 1 mol Succinat aus 1 mol Glycerin unter Fixierung von 1 mol CO2 ist redoxneutral und stellt die theoretisch maximale Succinatausbeute dar. Zuerst wurde eine Methode entwickelt, um die Succinatproduktion verschiedener Stämme schnell und einfach miteinander vergleichen zu können. Diese Biotransformationen im Kleinmaßstab wurden in 1,5 ml Plastikgefäßen durchgeführt. Zuvor wurden diese mit 1,2 ml einer Zellsuspension von 0,5 OD600/ml in M9-Minimalmedium gefüllt, welches definierte Mengen Glycerin und Hydrogencarbonat enthielt. Anschließend wurde der zeitliche Verlauf der Zelldichte und der exkretierten Metabolite gemessen. Nach einem anfänglichen, kleinen Anstieg der Zelldichte auf durchschnittlich 0,7 OD600/ml blieb diese während des Produktionszeitraumes bis zu 15 Tage konstant. In einem Experiment wurde der Einbau von 13C-markiertem Hydrogencarbonat in das gebildete Succinat per Massenspektrometrie bestätigt. Verschiedene Stoffwechselwege führen zum Succinat. Aus diesen Wegen wurden drei Strategien zur Succinatproduktion abgeleitet, wobei jede Strategie eine Kombination mehrerer Wege beinhaltete. Der metabolische Fluß über bestimmte Wege wurde durch die Deletion von Genen mit der λRed-Rekombinationsmethode oder durch Plasmid-basierte Expression von Genen, die für auf den jeweiligen Routen benötigte Enzyme codieren, begünstigt. Außerdem sollten die Deletionen die Entstehung von Nebenprodukten wie beispielsweise Acetat verhindern. Nach der ersten Strategie sollte Succinat durch PEP-Carboxylierung und über den Glyoxylatzyklus produziert werden. Dem Stamm ss328 (ΔackA-pta ΔmgsA ΔgldA ΔtdcE ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) fehlt der Großteil der Pyruvat-verbrauchenden Enzyme. Zusätzlich wurde die Acetatentstehung verhindert. Stamm ss328 verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 43,2 ± 5,7 mM Glycerin und bildete 28,1 ± 3,3 mM Succinat. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 65,1 ± 1,4 %. Nach der zweiten Strategie sollte Succinat neben PEP-Carboxylierung vor allem durch Pyruvat-Carboxylierung gebildet werden. Stamm ss331 (ΔlipA ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) kann viele Pyruvat-verbrauchende Enzyme nicht mehr synthetisieren. Außerdem ist wegen ΔlipA der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex inaktiv, falls keine Liponsäure zugegeben wird. ss331 wurde mit Plasmid pSS84.4 transformiert, welches das Gen für das Malic-Enzym 2 von Arabidopsis thaliana trug. Der resultierende Stamm verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 37,6 ± 1,4 mM Glycerin und bildete 26,6 ± 0,7 mM Succinat. Dies kam einer molaren Succinatausbeute von 70,9 ± 0,7 % gleich. Nach der dritten Strategie sollte Succinat ausschließlich durch PEP-Carboxylierung entstehen, weswegen die Gene pykA und pykF, die für Pyruvatkinasen codieren, deletiert wurden. Die Pyruvatkinasen katalysieren die direkte Umwandlung von PEP in Pyruvat. Die erhaltenen Stämme konnten auf Glycerin kaum wachsen, da sie nur ungenügende Mengen Pyruvat bilden konnten. Erst nach einer Selektion auf schnelleres Wachstum in Minimalmedium mit Glycerin zeigten die erhaltenen Mutanten Wachstumsraten im Bereich von 0,3 h-1. Pyruvat wurde in diesen Stämmen vermutlich verstärkt über die POMP-Umleitung gebildet, welche folgende Schritte beinhaltet: PEP-Carboxylierung zum Oxalacetat, Umwandlung von Oxalacetat in Malat und Decarboxylierung von Malat zum Pyruvat. Mit dem Stamm ss279 (ΔgldA ΔtdcE ΔpykA ΔpykF ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) wurde in Biotransformationen mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 57,8 ± 2,8 mM Glycerin verbraucht und 47,1 ± 1,1 mM Succinat gebildet. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 81,5 ± 2,0 %. Berücksichtigt man nur den reinen Produktionszeitraum ohne Zellmassebildung ab dem zweiten Tag, so wurden noch höhere Ausbeuten von 89,5 ± 3,7 % erhalten.Item Open Access Spectinomycin und Netropsin - Biosynthese und Resistenz in den Produzentenstämmen der Gattung Streptomyces(2003) Stumpp, Tina V. M.; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Die beiden Antibiotika Spectinomycin und Netropsin werden von verschiedenen Streptomyceten synthetisiert. Einige der Produzentenstämme wurden hinsichtlich ihrer phäno- und genotypischen Eigenschaften näher charakterisiert und verglichen. Dabei konnten zwischen den Stämmen Streptomyces flavopersicus NRRL B-2820, Streptoverticillium baldaccii ATCC19756 und Streptomyces netropsis DSM40093 keine Unterschiede fest-gestellt werden. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde hauptsächlich der Stamm S. flavopersicus NRRL B-2820 herangezogen. Nach einer Optimierung der Kulturbedingungen wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Spectinomycin von S. flavopersicus NRRL B-2820 in hinreichender Menge gebildet. Durch Modifikation bekannter Methoden konnte der Wirkstoff aus den Kulturüberständen des Stammes aufgereinigt und anhand von Agarplatten-Diffusionsassays, Dünnschichtchromatographie und HPLC-Analytik nachgewiesen werden. Ein Problem im Nachweis der Spectinomycin-Produktion stellte die Synthese eines zweiten Antibiotikums dar, das vorher nicht in S. flavopersicus gefunden worden war. Aufgrund der Eigenschaften dieses Wirkstoffs und der Ähnlichkeit von S. flavopersicus NRRL B-2820 mit S. netropsis DSM40259, einem Netropsin-Produzenten, wurde vermutet, dass es sich dabei um das Peptid-Antibiotikum Netropsin handelt. Ein bereits bekannter und sequenzierter Teil des Spectinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. flavopersicus NRRL B-2820 diente als Ausgangspunkt, um in einer Genbank nach weiteren Synthesegenen zu suchen. Ein Cosmid mit dem vermeintlich gesamten Biosynthese-Cluster bestehend aus 16 offenen Leserahmen (spcRNTABCDXEYFGHIJK) wurde identifiziert. Über Homologie-Vergleiche und der Suche nach konservierten Regionen konnten den daraus abgeleiteten Proteinen mögliche Funktionen zugeteilt und sie Protein-Familien zugeordnet werden. Danach gibt es einen Transkriptionsregulator, ein Protein für Spectinomycin-Resistenz, ein Transportprotein, eine Monophosphatase, zwei Dehydrogenasen, zwei Aminotransferasen/Dehydratasen, eine Epimerase, eine Keto-Isomerase, eine 4,6-Dehydratase, eine Glykosyltransferase, eine Methyltransferase, eine Thymidylyltransferase, ein Zuckerbinde-protein und ein Protein mit Ähnlichkeit zu Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseproteinen. Das Synthese-Cluster wurde mit den bereits bekannten Spectinomycin-Biosynthesegenen aus S. spectabilis NRRL2494 und S. spectabilis NRRL2792 verglichen. Anhand aller verfügbaren Daten konnte ein möglicher Biosyntheseweg für Spectinomycin postuliert werden. Das für die Spectinomycin-Resistenz verantwortliche Enzym in S. flavopersicus NRRL B-2820 und S. spectabilis NRRL2494 ist eine Spectinomycin-Phosphotransferase SpcN. Das Protein aus S. spectabilis wurde in Escherichia coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mit Hilfe verschiedener Aktivitätstests wurde festgestellt, dass das Enzym mit ATP spezifisch Spectinomycin und Dihydrospectinomycin phosphoryliert. Eine Inaktivierung anderer Aminoglykosid-Antibiotika so wie eine kompetitive Inhibition des Enzyms durch die Substanzen konnte nicht nachgewiesen werden. Der KM-Wert der Spectinomycin-Phosphotransferase für Spectinomycin betrug etwa 20 µM. Die Gene für die beiden Dehydrogenasen, SpcB und SpcH, aus dem Spectinomycin-Gencluster von S. flavopersicus konnten in E. coli nur in geringer Menge exprimiert werden. Im postulierten Biosyntheseweg von Spectinomycin könnten sie mehrere Oxidations-/Reduktionsreaktionen katalysieren. Mit einigen der möglichen Substrate, myo-Inositol, scyllo-Inosose, Spectinomycin und Dihydrospectinomycin, konnte in in vitro mit NAD(P)+ bzw. NAD(P)H als Coenzym jedoch keine Aktivität festgestellt werden. Die Inaktivierung einiger Biosynthesegene über verschiedene Methoden zeigte keinen Erfolg. Dies lag zum einen daran, dass für S. flavopersicus kein zufriedenstellendes Transformationsprotokoll erstellt werden konnte, und zum anderen daran, dass durch das Fehlen von Sporen die Mutanten inhomogen waren, und in einem Myzel Wildtyp- und mutierte Sequenz parallel vorkamen. Daher konnten die Ansätze zur kombinatorischen Biosynthese, d.h. der Austausch des Methyltransferasegens spcG in S. flavopersicus gegen das Amidinotransferasegen strB1 aus S. griseus, nicht verwirklicht werden. Dagegen führte der umgekehrte Austausch von strB1 gegen spcG in S. griseus zu Mutanten, die keine antibiotische Aktivität mehr aufwiesen. Des Weiteren wurden die Netropsin-Resistenzgene netP1 und netP2 aus S. flavopersicus NRRL B-2820 isoliert. Die daraus abgeleiteten Proteine zeigten Homologie zu ABC-Transportern und wiesen charakteristische Motive dieser Proteine auf, insbesondere eine Transmembran- und eine ATP-Bindedomäne. Verschiedene Mutanten in netP1 und netP2 wurden in unterschiedlichen Tests auf ihre Netropsin-Resistenz untersucht. Aufgrund der Ergebnisse wird postuliert, dass NetP1 und NetP2 als Heterodimer wirken, aber zu einem sehr geringen Teil auch als Homodimer aktiv sind.Item Open Access Charakterisierung des Regulators ManR und die Anwendung des Mannose Expressionssystems in Bacillus subtilis(2013) Wenzel, Marian; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)In dieser Arbeit wurde der Transkriptionsaktivator ManR des Bacillus subtilis Operons für den Mannose-Metabolismus näher charakterisiert. Er besteht aus einer N-terminalen DNA-Bindedomäne, zwei Phosphotransferasesystem (PTS)-Regula-tionsdomänen (PRDs) sowie einer EII_Bgl- und einer EIIA_Fru-ähnlichen Domäne. In Analogie zu anderen PRD-haltigen Regulatoren war eine Steuerung der Aktivität von ManR durch Phosphorylierung wahrscheinlich. Die ortsgerichtete Mutagenese von ManR wurde verwendet, um die Rolle seiner konservierten Aminosäure-Reste als potentielle Phosphorylierungsstellen zu untersuchen. Die Aktivität der ManR-Mutanten wurde in vivo über beta-Galaktosidase-Aktivitätstests sowie in vitro über Gel-mobilityshift Assays nachgewiesen. Für die in vitro Versuche mussten die isolierten ManR-Moleküle zuvor mit den PTS-Komponenten HPr, EI und PEP aktiviert werden. Mutationen in der PRD1 reduzierten die Aktivität von ManR, während Mutationen in der PRD2 diese vollständig aufhoben. Die Cys415Ala-(EIIB_Bgl) und die His570Ala-Mutationen (EIIA_Fru) riefen konstitutive Aktivitäten unterschiedlichen Ausmaßes hervor, wobei letztere den größeren Einfluss hatte. Im Wildtyp und in der Cys415Ala-Mutante verringerte die Anwesenheit der PTS-Transporterdomänen EIIBAMan die DNA-Bindeaktivität von ManR signifikant. Dies war jedoch nicht bei der His570Ala-Mutante der Fall. Durch den Austausch der konservierten Amino-säuren von ManR gegen Aspartat konnte keine Phosphomimikry beobachtet werden. Die unterschiedlichen Expressionsniveaus ausgehend von den ManR-kontrollierten Promotoren von manR (PmanR) und des manPA-yjdF Operons (PmanP) konnten der unterschiedlichen 5’-untranslatierten Region der mRNAs zugeordnet werden. Über DNase I Footprinting Experimente wurden palindromähnliche Sequenzen mit einer Länge von 44 bp als ManR-Bindestellen identifiziert. Des Weiteren wurden die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten KD und die Dissoziationsraten kdiss von ManR bezüglich beider Promotorregionen bestimmt. Das Mannose-induzierbare Expressionssystem zur Produktion heterologer Proteine in B. subtilis führt zu relativ hohen Produktausbeuten, benötigt dafür jedoch hohe Mengen des teuren Induktors Mannose. Die Deletion des Gens für die Mannose-6-phosphat-Isomerase manA reduziert zwar den Induktorverbrauch, führt jedoch zur Sensitivität der Zellen gegenüber Mannose. Preisgünstiger, Mannose-haltiger Hefe-extrakt wurde als Induktoralternative getestet, zeigte jedoch nur eine geringe Induktionswirkung. Um die Produktausbeute bei gleichzeitiger Reduzierung der Induktorkosten zu steigern, wurde deshalb ein neuartiges, selbstinduzierendes Expressionssystem mit dem PTS-Transporter negativen Stamm B. subtilis TQ356 (spo0A3 delta_manP::ermC) entwickelt, bei dem Glucose die Induktion durch Katabolit-repression verhindert. Für optimale selbstinduzierende Bedingungen wurde eine Glucose-limitierende Prozessstrategie, nämlich ein Fed-Batch-Prozess, herangezogen: Die Selbstinduktion startet mit dem Beginn des Übergangs von der Batch- in die Zufütterungsphase, an dem Glucose limitierend wird, und bleibt während der gesamten Glucose-limitierten Zufütterungsphase erhalten. Dies führt im Vergleich zum Standardsystem zu einer Steigerung der Produktausbeute um fast das 3-fache. Der für das neue System verwendete, pUB110-basierte eGFP-Expressionsvektor (pMW168.1), der nach dem Rolling-Circle-Mechanismus repliziert, zeigte Instabilität bei der Segregation. Die Verwendung eines Replicons, welches nach dem Theta-Mechanismus repliziert, stabilisierte die Weitergabe an die Tochterzellen. Da mit diesem Replicon allerdings auch eine Reduzierung der Plasmidkopienzahl einher-ging, reduzierte sich entsprechend auch die Ausbeute und Produktivität des selbstinduzierenden Systems mit diesem Vektor. Selbst durch eine Erhöhung der Kopienzahl desselben Vektors wurden nicht die Werte erreicht, die mit pMW168.1 erzielt wurden. Die Anwendung der Alanin-Racemase als metabolischen Selektions-marker funktionierte zwar in Schüttelkolbenexperimenten, jedoch nicht bei der Anwendung in der Hochzelldichtefermentation. Die verwendeten Medien zeigten einen starken Einfluss auf die Expression von eGFP mit diesem System: Die Spurenelemente führten zu einem beschleunigten Wachstum, wodurch die Zellen länger in Glucose-Limitation waren und dement-sprechend mehr eGFP produzieren konnten. Der beobachtete negative Effekt der Casamino Acids auf die eGFP Expression wurde eingehend untersucht, führte jedoch zu keinem eindeutigen Resultat in Bezug auf eine bestimmte Komponente oder bestimmten Regulator.Item Open Access Regulation der Gene für die Verwertung von Rhamnose und Heteromannan in Bacillus subtilis(2019) Habersetzer, Stefanie; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr. rer. nat.)In dieser Arbeit wurde die Regulation der Gene für die Verwertung von L-Rhamnose (rhaEWRBMA) und der Hemicellulose Heteromannan (gmuBACDREFG) in Bacillus subtilis untersucht. Die Abbaugene sind jeweils in einem Operon mit einem internen Regulatorgen (rhaR bzw. gmuR) zusammengefasst. Die Regulation des Rhamnose-Promotors (PrhaEW) wurde mittels lacZ-Reporteranalysen untersucht. PrhaEW wird durch den DeoR-ähnlichen Regulator RhaR negativ reguliert und durch Rhamnose induziert. Außerdem unterliegt die Expression des Rhamnose-Operons der Kohlenstoff-Katabolitrepression und wird bei gleichzeitiger Anwesenheit einer bevorzugten Kohlenstoffquelle wie Glucose über eine funktionelle cre-Sequenz (für catabolite responsive element) innerhalb von PrhaEW unterdrückt. L-Rhamnose wird in B. subtilis durch 5 enzymatisch katalysierte Schritte zu L-Lactat und Dihydroxyacetonphosphat umgesetzt. Durch Deletion der einzelnen Strukturgene wurde in vivo gezeigt, dass das phosphorylierte Intermediat Rhamnulose-1-Phosphat (R1P) der eigentliche Induktor ist. Mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde die spezifische Interaktion des Repressors RhaR mit seinem Operator stromaufwärts des ersten Gens nachgewiesen. In Abhängigkeit von der RhaR-Konzentration konnte die Bildung von zwei unterschiedlich großen PrhaEW-RhaR-Komplexen beobachtet werden, die in Gegenwart des Effektormoleküls R1P wieder dissoziierten. In DNase I-Footprinting-Experimenten wurden zwei durch RhaR geschützte Bereiche identifiziert. Der erste, größere Sequenzabschnitt (38-45 nt) enthält eine direkte Sequenzwiederholung aus zwei 17 bp langen Sequenzen CAAAAA(T/C)AAACA(A/G)AAA(C/T), die unerlässlich für die RhaR-Bindung ist. Diese RhaR-Bindestelle konnte auch durch eine Deletionsanalyse von PrhaEW sowie durch komplementäre Basensubstitutionen, die blockweise eingeführt wurden, bestätigt werden. In der kürzeren zusätzlich durch RhaR geschützten Region (22 nt) tritt das von der ersten Bindestelle abgeleitete 17 bp lange Sequenzmotiv CAAAAACAAACANAAAT mit wenigen Abweichungen erneut auf. Eine Gel-Permeations-Chromatographie ergab, dass RhaR in Lösung als Monomer vorliegt. Daher binden in Abwesenheit von Rhamnose vermutlich drei RhaR-Monomere an diese drei direkt wiederholten Sequenzen im Bereich der -35 und der -10 Region und verhindern die Bindung der RNA-Polymerase. Die Tatsache, dass B. subtilis mit Rhamnose als einziger Kohlenstoffquelle kaum wächst, könnte an dem Fehlen eines Transporters liegen. Durch die heterologe Expression eines Gens für eine mutmaßliche Rhamnose-Permease (rhaY) aus Oceanobacillus iheyensis konnte das Wachstum auf Rhamnose deutlich verbessert werden. Warum aber dafür eine extrem lange Adaptationszeit nötig war, konnte nicht geklärt werden. Das Glucomannan-Operon (gmu-Operon) von B. subtilis kodiert für Gene, die mutmaßlich für die Regulation, die extrazelluläre Hydrolyse von β-1,4-Heteromannan-Polysacchariden sowie die Aufnahme und den Abbau der dabei entstehenden oligomeren β-Mannoside verantwortlich sind. Hier durchgeführte genetische Analysen deuten darauf hin, dass die Oligosaccharide intrazellulär bis zum Monomer D-Mannose hydrolysiert werden. Durch Promotorstudien mit lacZ als Reporter und dem einzigen, vor dem ersten Gen gmuB liegenden Promotor (PgmuB) wurde gezeigt, dass das gmu-Operon neben Glucomannan auch durch Galactomannan induziert werden kann. Die Messungen der Promotoraktivität in Stoffwechselmutanten der Heteromannan-Verwertung lassen darauf schließen, dass es sich bei dem Effektormolekül des Repressors GmuR um ein phosphoryliertes Abbauprodukt der extrazellulären Mannanase GmuG (vermutlich β-1,4-Mannobiose) handelt, welches durch Aufnahme über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Transportsystem entsteht. Durch EMSA wurde gezeigt, dass der GntR/HutC-ähnliche Repressor GmuR an seinen Operator stromaufwärts des gmu-Operons bindet und dabei, abhängig von der Proteinkonzentration, nacheinander zwei PgmuB-GmuR-Komplexe mit unterschiedlicher Mobilität ausbildet. Dieser Arbeit vorausgegangene bioinformatische Studien sagten eine 18 bp lange Bindestelle für GmuR vorher (IR1), die mittig das konservierte DNA-Motiv der HutC-Familie (GTNTANAC) enthält. Diese zentrale Sequenz, welche mit der -35 Region überlappt, wird von zwei inversen 7 bp langen Wiederholungen umgeben. Der entsprechende Bereich wurde im DNase I-Footprinting-Experiment durch GmuR geschützt. Allerdings folgte auf den 37 nt großen Abschnitt ein zusätzlicher kleinerer geschützter Abschnitt (10 nt) der die -10 Region bedeckt. Dieser Bereich enthält eine weitere invertierte Wiederholung des 7 bp langen DNA-Motivs TAAWWGT mit geringen Nukleotidabweichungen (‘IR2). Durch komplementäre Basensubstitutionen wurde bestätigt, dass diese Sequenz Einfluss auf die Affinität von GmuR hat. Ein Modell wurde vorgeschlagen, bei dem ein GmuR-Dimer an IR1 und ein weiteres an ‘IR2 bindet, wodurch die Bindung der RNA-Polymerase an den gmuB-Promotor blockiert wird.Item Open Access TAL1 und miR-17-92 bilden eine regulatorische Schleife in der Hämatopoese(2020) Meyer, Annekarin; Lausen, Jörn (Prof. Dr.)Item Open Access Regulation of the mannitol utilization genes in Bacillus subtilis(2013) Morabbi Heravi, Kambiz; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Bacillus subtilis takes up mannitol by a phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS). The mannitol utilization system is encoded by the mtlAFD operon consisting of mtlA (encoding membrane-bound EIICBMtl), mtlF (encoding phosphocarrier EIIAMtl), and mtlD (encoding mannitol 1-phosphate dehydrogenase). This operon is activated by MtlR whose coding gene is located approx. 14.4 kb downstream of the operon. The regulation of the mannitol utilization genes in B. subtilis was studied by fusion of the promoters of mtlAFD (PmtlA) and mtlR (PmtlR) to lacZ as a reporter gene. Both the PmtlA and PmtlR were inducible by mannitol and glucitol, while glucose reduced their activities. The promoter strength of PmtlA was about 4.5-fold higher than that of PmtlR. Identification of the transcription start sites of PmtlA and PmtlR revealed that both of these promoters contain a sigma A-type promoter structure. The promoter -35 and -10 boxes in PmtlA were TTGTAT and TAACAT and in PmtlR TTGATT and TATATT, respectively. Catabolite responsive elements (cre) were detected in the sequences of PmtlA and PmtlR overlapping the -10 boxes. Shortening the mRNA 5’untranslated region (5’UTR) increased the PmtlA activity, whereas PmtlR activity was decreased by shortening of its mRNA 5’UTR. Alignment of the -35 upstream sequences of PmtlA and PmtlR revealed the putative MtlR binding site. This sequence comprised a similar incomplete inverted repeat in both the PmtlA and PmtlR sequences (TTGNCACAN4TGTGNCAA). This sequence was encompassed by two 11 bp distal and proximal flanking sequences. Construction of PmtlA-PlicB hybrid promoters and shortening of the 5’-end of PmtlA indicated the probable boundaries of putative MtlR binding site in PmtlA. Increasing the distance between the putative MtlR binding site and -35 box lowered the PmtlA maximal activity, although PmtlA remained inducible by mannitol. PmtlA became inactive by disruption of the TTGNCACAN4TGTGNCAA sequence. In contrast, manipulation of the distal and proximal flanking sequences only reduced the maximal activity of PmtlA, whereas PmtlA remained highly inducible. These flanking sequences contained AT-rich repeats similar to the consensus sequence of alpha CTD binding sites. Regulation of PmtlA and PmtlR was investigated by deletion of mtlAF, mtlF, mtlD, and mtlR. Deletion of the mtlAF genes rendered PmtlA and PmtlR constitutive showing the inhibitory effect of EIICBMtl and EIIAMtl (PTS transporter components) on MtlR in the absence of mannitol. The constitutive activity of PmtlA was increased by the deletion of mtlF. In contrast, the deletion of mtlAFD showed a significant reduction in the PmtlA constitutive activity. Disruption of mtlD made B. subtilis sensitive to mannitol in a way that addition of mannitol or glucitol to the bacterial culture ended in cell lysis. Besides, PmtlA and PmtlR were similarly induced by glucitol and mannitol in a mtlD::erm mutant. Also, deletion of mtlR rendered PmtlA and PmtlR uninducible by mannitol or glucitol. In contrast, deletion of the glucitol utilization genes had no influence on the inducibility of PmtlA or PmtlR by glucitol. The PmtlA activity was drastically reduced in ptsH-H15A (HPr-H15A) mutant similar to the delta mtlR mutant. The mutation of histidine 289 in the PRDI domain of MtlR to alanine reduced the activity of PmtlA, whereas the PmtlA activity in the mtlR H230A mutant was almost similar to wild type. In contrast, mutation of the PRDII domain of MtlR to H342D mainly relieved PmtlA from glucose repression. Moreover, MtlR double mutant H342D C419A which was produced in E. coli was shown to be active in vitro. These results represent the positive regulation of MtlR via phosphorylation of the PRDII domain by HPr(H15~P). Also, dephosphorylation of the domains EIIBGat- and EIIAMtl-like of MtlR by EIIAMtl and EIICBMtl transporter components causes activation. The PmtlA activity was repressed in the presence of glucose and fructose, while sucrose and mannose had no influence on the PmtlA activity. Therefore, catabolite repression of PmtlA and PmtlR were studied by CcpA-dependent carbon catabolite repression mutants, such as ptsH-S46A, delta crh, delta hprK, and delta ccpA. Induction of PmtlA and PmtlR in these mutants did not result in a complete loss of catabolite repression. Therefore, the catabolite responsive elements (cre sites) of PmtlA and PmtlR were investigated. Using a constitutive promoter, PgroE, it was shown that the cre sites of PmtlA and PmtlR were weakly functional. In contrast, deletion of the glucose PTS transporter, encoded by ptsG, resulted in a complete loss of glucose repression in PmtlA and PmtlR. Thus, the main glucose repression of mannitol PTS function at the posttranslational level in a HPr-mediated manner via MtlR-H342 and at transcriptional level by CcpA-dependent carbon catabolite repression.