04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Construction of a super-competent Bacillus subtilis 168 using the PmtlA-comKS inducible cassette(2015) Rahmer, Regine; Morabbi Heravi, Kambiz; Altenbuchner, JosefCompetence is a physiological state that enables Bacillus subtilis 168 to take up and internalize extracellular DNA. In practice, only a small subpopulation of B. subtilis 168 cells becomes competent when they enter stationary phase. In this study, we developed a new transformation method to improve the transformation efficiency of B. subtilis 168, specially in rich media. At first, different competence genes, namely comK, comS, and dprA, were alone or together integrated into the chromosome of B. subtilis 168 under control of mannitol-inducible PmtlA promoter. Overexpression of both comK and comS increased the transformation efficiency of B. subtilis REG19 with plasmid DNA by 6.7-fold compared to the wild type strain 168. This transformation efficiency reached its maximal level after 1.5 h of induction by mannitol. Besides, transformability of the REG19 cells was saturated in the presence of 100 ng dimeric plasmid or 3000 ng chromosomal DNA. Studying the influence of global regulators on the development of competence pointed out that important competence development factors, such as Spo0A, ComQXPA, and DegU, could be removed in REG19. On the other hand, efficient REG19 transformation remained highly dependent on the original copies of comK and comS regardless of the presence of PmtlA-comKS. Finally, novel plasmid-free strategies were used for transformation of REG19 based on Gibson assembly.Item Open Access Transformation von B. subtilis 168 : Optimierung und Regulation des Transkriptionsfaktors ComK(2017) Franzen, Regine; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)Item Open Access Das konservierte Zellproliferationsgen CDC123 kodiert für einen Initiationsfaktor der Translation: 2gamma-AP(2006) Richter, Frank; Seufert, Wolfgang (Prof. Dr.)Das Genprodukt von CDC123 in Saccharomyces cerevisiae ist essentiell und hochkonserviert. Es existieren Homologe in anderen niederen Eukaryonten ebenso wie in der Ackerschmalwand, dem Zebrafisch, der Maus oder auch dem Menschen. Ergebnisse zu dem orthologen Gen D123 aus einer Ratten-Fibroblastenzelllinie (3Y1) wurden erstmals 1984 publiziert. Es wurden konditionale Mutanten erzeugt, denen es bei restriktiver Temperatur nicht möglich war, in den Zellzyklus einzutreten und die DNA-Replikation zu initiieren. Das Interesse galt dabei der Identifikation neuer Regulatoren der Zellproliferation, um den Vorgang der Transformation hin zu unkontrolliert proliferierenden Zellen zu verstehen. Bei der Mutante 3Y1tsD123 konnte nach Inkubation bei restriktiver Temperatur ein Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Das mutierte Gen konnte kloniert und ein Nukleotidaustausch, der zu einem Aminosäureaustausch führte (A109V), nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen wiesen eine Proteasom-abhängige Instabilität dieses mutierten Proteins nach. Ebenso wurde eine teilweise granuläre Lokalisation von D123 im Cytoplasma und ein Kernausschluss beobachtet. Mögliche Phosphorylierungsstellen wurden ebenso beschrieben wie eine Homologie zu dem bis zum Beginn dieser Arbeit unbekannten ORF YLR215C in S. cerevisiae. YLR215C erhielt den Namen CDC123 in der Saccharomyces Genom Datenbank. In dieser Arbeit sollte CDC123 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht und eine molekulare Erklärung für die in Säugerzellen beobachteten Phänotypen gefunden werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Homologie von Cdc123 zu D123 nicht nur auf Sequenzebene existiert, sondern dass eine Deletion von CDC123 in Hefe durch das humane orthologe D123 komplementiert werden kann. Ebenso wie D123 in Säugerzellen ist auch Cdc123 in Hefe essentiell für den Eintritt in den Zellzyklus und das Verlassen der G1-Phase. Mit Hilfe der SGA-Analyse, der systematischen Suche nach synthetisch genetischen Interaktionen mit den ca. 4700 zur Verfügung stehenden Deletionen nicht essentieller Gene in S. cerevisiae, konnten 50 Gene identifiziert werden, die mit CDC123 in Verbindung stehen. Es waren Gene unterschiedlichster Bereiche zellulärer Funktion und Lokalisation dabei, die eine funktionale Einordnung von CDC123 allein aufgrund dieser Interaktionen unmöglich machte. Eine Gruppe von 6 Genen (GCN3, TIF1, TIF2, TIF3, TIF4631, TIF4632), allesamt Translationsinitiationsfaktoren, erschien vor dem Hintergrund einer publizierten Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 vielversprechend. Daraufhin konnte ebenfalls eine synthetische Interaktion (letal, bzw. krank) zwischen cdc123-Mutanten und GCD11- bzw. SUI2-Allelen (Untereinheiten gamma und alpha des Initiationsfaktors eIF2) gefunden werden. Interaktionsstudien mit verschiedenen an der Translationsinitiation beteiligten Faktoren zeigten, dass Cdc123 ausschließlich mit eIF2 interagiert, nicht aber mit dessen Nukleotidaustauschfaktor eIF2B oder eIF3, Teil des Multifaktorkomplexes (MFC) und des 43S Präinitiationskomplexes. Die Interaktion kann in einem von Ribosomen geklärten Überstand, frei von der 40S oder 60S ribosomalen Untereinheit, stattfinden. Zusammen deutet dies auf eine Interaktion von Cdc123 mit Gcd11 in einem frühen Stadium der Translationsinitiation vor der Assoziation von eIF2 mit eIF3, d.h. dem MFC oder der 40S ribosomalen Untereinheit hin. Nach Inaktivierung von Cdc123-1 kann ein Verlust an Polysomen und eine Derepression der GCN4-Expression beobachtet werden. Sowohl das veränderte Polysomenprofil als auch die derepremierte GCN4-Expression sind Hinweise auf eine reduzierte Translationsinitiation. eIF2gamma wird, anders als die Untereinheiten alpha und beta, nach dem Verlust der Cdc123-Aktivität bei 25°C leicht und bei 37°C vermehrt instabil. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Abnahme der Gcd11-Menge nicht den primären Grund für die Wachstumsbeeinträchtigung der Cdc123-Mutanten darstellt. Vielmehr ist die Interaktion von eIF2gamma mit eIF2alpha und eIF2beta durch den Verlust der Cdc123-Aktivität stark reduziert. Dieser molekulare Befund wird als Ursache sowohl für den Arrest in der G1-Phase als auch für die reduzierte Translationsinitiation in Cdc123-Mutanten angesehen. In Übereinstimmung damit kann eine Deletion von CDC123, d.h. eine geringere Verfügbarkeit von eIF2 durch die Überexpression der Untereinheiten von eIF2 bedingt gerettet werden. Eine Überexpression der einzelnen Untereinheiten ermöglicht nur minimales Wachstum, wohingegen eine Kombination von eIF2gamma mit eIF2alpha oder aller drei Untereinheiten annähernd Wildtypwachstum zulässt. Cdc123 stellt somit einen neuen, für die Translationsinitiation essentiellen Faktor dar. Es ist notwendig für die effiziente Bereitstellung des eIF2-Komplexes, auf die möglicherweise über Cdc123 regulatorisch eingewirkt werden kann.Item Open Access Optimierung der Genexpression in Escherichia coli und Thermus thermophilus(2017) Wang, Lei; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Item Open Access The transcription factor TAL1 and miR-17-92 create a regulatory loop in hematopoiesis(2020) Meyer, Annekarin; Herkt, Stefanie; Kunze-Schumacher, Heike; Kohrs, Nicole; Ringleb, Julia; Schneider, Lucas; Kuvardina, Olga N.; Oellerich, Thomas; Häupl, Björn; Krueger, Andreas; Seifried, Erhard; Bonig, Halvard; Lausen, JoernA network of gene regulatory factors such as transcription factors and microRNAs establish and maintain gene expression patterns during hematopoiesis. In this network, transcription factors regulate each other and are involved in regulatory loops with microRNAs. The microRNA cluster miR-17-92 is located within the MIR17HG gene and encodes six mature microRNAs. It is important for hematopoietic differentiation and plays a central role in malignant disease. However, the transcription factors downstream of miR-17-92 are largely elusive and the transcriptional regulation of miR-17-92 is not fully understood. Here we show that miR-17-92 forms a regulatory loop with the transcription factor TAL1. The miR-17-92 cluster inhibits expression of TAL1 and indirectly leads to decreased stability of the TAL1 transcriptional complex. We found that TAL1 and its heterodimerization partner E47 regulate miR-17-92 transcriptionally. Furthermore, miR-17-92 negatively influences erythroid differentiation, a process that depends on gene activation by the TAL1 complex. Our data give example of how transcription factor activity is fine-tuned during normal hematopoiesis. We postulate that disturbance of the regulatory loop between TAL1 and the miR-17-92 cluster could be an important step in cancer development and progression.Item Open Access Investigation of the interaction of PRMT6 and LEF1/β-catenin in hematopoiesis(2021) Schneider, Lucas; Lausen, Jörn (Prof. Dr.)Item Open Access Konstruktion von Escherichia coli Produktionsstämmen zur fermentativen Herstellung von Succinat aus Glycerin(2012) Söllner, Stefan; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Glycerin fällt in großen Mengen bei der Biodieselproduktion an und kann als billiger, nachwachsender Rohstoff betrachtet werden, aus dem sich biotechnologisch viele industriell relevante Fein- oder Bulkchemikalien herstellen lassen. Eine der Bulkchemikalien ist Succinat, das Anion der Bernsteinsäure, welche in Studien des Department of Energy der USA (DOE) in den Jahren 2004 und 2010 als wichtige Plattformchemikalie bezeichnet wurde. Plattformchemikalien bzw. chemische Bausteine können kostengünstig in eine Vielzahl von weiteren, höherpreisigen Materialien umgewandelt werden. In dieser Arbeit wurden Escherichia coli Produktionsstämme für Succinat konstruiert. Die Bildung größerer Zellmassen erfolgte vor der Produktionsphase in einer aeroben Wachstumsphase in Minimalmedium mit Glycerin als C-Quelle. In der mikroaeroben oder anaeroben Produktionsphase wurde dann wachstumsentkoppelt Succinat aus Glycerin und Kohlenstoffdioxid bzw. Hydrogencarbonat gebildet. Die Entstehung von 1 mol Succinat aus 1 mol Glycerin unter Fixierung von 1 mol CO2 ist redoxneutral und stellt die theoretisch maximale Succinatausbeute dar. Zuerst wurde eine Methode entwickelt, um die Succinatproduktion verschiedener Stämme schnell und einfach miteinander vergleichen zu können. Diese Biotransformationen im Kleinmaßstab wurden in 1,5 ml Plastikgefäßen durchgeführt. Zuvor wurden diese mit 1,2 ml einer Zellsuspension von 0,5 OD600/ml in M9-Minimalmedium gefüllt, welches definierte Mengen Glycerin und Hydrogencarbonat enthielt. Anschließend wurde der zeitliche Verlauf der Zelldichte und der exkretierten Metabolite gemessen. Nach einem anfänglichen, kleinen Anstieg der Zelldichte auf durchschnittlich 0,7 OD600/ml blieb diese während des Produktionszeitraumes bis zu 15 Tage konstant. In einem Experiment wurde der Einbau von 13C-markiertem Hydrogencarbonat in das gebildete Succinat per Massenspektrometrie bestätigt. Verschiedene Stoffwechselwege führen zum Succinat. Aus diesen Wegen wurden drei Strategien zur Succinatproduktion abgeleitet, wobei jede Strategie eine Kombination mehrerer Wege beinhaltete. Der metabolische Fluß über bestimmte Wege wurde durch die Deletion von Genen mit der λRed-Rekombinationsmethode oder durch Plasmid-basierte Expression von Genen, die für auf den jeweiligen Routen benötigte Enzyme codieren, begünstigt. Außerdem sollten die Deletionen die Entstehung von Nebenprodukten wie beispielsweise Acetat verhindern. Nach der ersten Strategie sollte Succinat durch PEP-Carboxylierung und über den Glyoxylatzyklus produziert werden. Dem Stamm ss328 (ΔackA-pta ΔmgsA ΔgldA ΔtdcE ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) fehlt der Großteil der Pyruvat-verbrauchenden Enzyme. Zusätzlich wurde die Acetatentstehung verhindert. Stamm ss328 verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 43,2 ± 5,7 mM Glycerin und bildete 28,1 ± 3,3 mM Succinat. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 65,1 ± 1,4 %. Nach der zweiten Strategie sollte Succinat neben PEP-Carboxylierung vor allem durch Pyruvat-Carboxylierung gebildet werden. Stamm ss331 (ΔlipA ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) kann viele Pyruvat-verbrauchende Enzyme nicht mehr synthetisieren. Außerdem ist wegen ΔlipA der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex inaktiv, falls keine Liponsäure zugegeben wird. ss331 wurde mit Plasmid pSS84.4 transformiert, welches das Gen für das Malic-Enzym 2 von Arabidopsis thaliana trug. Der resultierende Stamm verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 37,6 ± 1,4 mM Glycerin und bildete 26,6 ± 0,7 mM Succinat. Dies kam einer molaren Succinatausbeute von 70,9 ± 0,7 % gleich. Nach der dritten Strategie sollte Succinat ausschließlich durch PEP-Carboxylierung entstehen, weswegen die Gene pykA und pykF, die für Pyruvatkinasen codieren, deletiert wurden. Die Pyruvatkinasen katalysieren die direkte Umwandlung von PEP in Pyruvat. Die erhaltenen Stämme konnten auf Glycerin kaum wachsen, da sie nur ungenügende Mengen Pyruvat bilden konnten. Erst nach einer Selektion auf schnelleres Wachstum in Minimalmedium mit Glycerin zeigten die erhaltenen Mutanten Wachstumsraten im Bereich von 0,3 h-1. Pyruvat wurde in diesen Stämmen vermutlich verstärkt über die POMP-Umleitung gebildet, welche folgende Schritte beinhaltet: PEP-Carboxylierung zum Oxalacetat, Umwandlung von Oxalacetat in Malat und Decarboxylierung von Malat zum Pyruvat. Mit dem Stamm ss279 (ΔgldA ΔtdcE ΔpykA ΔpykF ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) wurde in Biotransformationen mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 57,8 ± 2,8 mM Glycerin verbraucht und 47,1 ± 1,1 mM Succinat gebildet. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 81,5 ± 2,0 %. Berücksichtigt man nur den reinen Produktionszeitraum ohne Zellmassebildung ab dem zweiten Tag, so wurden noch höhere Ausbeuten von 89,5 ± 3,7 % erhalten.Item Open Access Spectinomycin und Netropsin - Biosynthese und Resistenz in den Produzentenstämmen der Gattung Streptomyces(2003) Stumpp, Tina V. M.; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Die beiden Antibiotika Spectinomycin und Netropsin werden von verschiedenen Streptomyceten synthetisiert. Einige der Produzentenstämme wurden hinsichtlich ihrer phäno- und genotypischen Eigenschaften näher charakterisiert und verglichen. Dabei konnten zwischen den Stämmen Streptomyces flavopersicus NRRL B-2820, Streptoverticillium baldaccii ATCC19756 und Streptomyces netropsis DSM40093 keine Unterschiede fest-gestellt werden. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde hauptsächlich der Stamm S. flavopersicus NRRL B-2820 herangezogen. Nach einer Optimierung der Kulturbedingungen wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Spectinomycin von S. flavopersicus NRRL B-2820 in hinreichender Menge gebildet. Durch Modifikation bekannter Methoden konnte der Wirkstoff aus den Kulturüberständen des Stammes aufgereinigt und anhand von Agarplatten-Diffusionsassays, Dünnschichtchromatographie und HPLC-Analytik nachgewiesen werden. Ein Problem im Nachweis der Spectinomycin-Produktion stellte die Synthese eines zweiten Antibiotikums dar, das vorher nicht in S. flavopersicus gefunden worden war. Aufgrund der Eigenschaften dieses Wirkstoffs und der Ähnlichkeit von S. flavopersicus NRRL B-2820 mit S. netropsis DSM40259, einem Netropsin-Produzenten, wurde vermutet, dass es sich dabei um das Peptid-Antibiotikum Netropsin handelt. Ein bereits bekannter und sequenzierter Teil des Spectinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. flavopersicus NRRL B-2820 diente als Ausgangspunkt, um in einer Genbank nach weiteren Synthesegenen zu suchen. Ein Cosmid mit dem vermeintlich gesamten Biosynthese-Cluster bestehend aus 16 offenen Leserahmen (spcRNTABCDXEYFGHIJK) wurde identifiziert. Über Homologie-Vergleiche und der Suche nach konservierten Regionen konnten den daraus abgeleiteten Proteinen mögliche Funktionen zugeteilt und sie Protein-Familien zugeordnet werden. Danach gibt es einen Transkriptionsregulator, ein Protein für Spectinomycin-Resistenz, ein Transportprotein, eine Monophosphatase, zwei Dehydrogenasen, zwei Aminotransferasen/Dehydratasen, eine Epimerase, eine Keto-Isomerase, eine 4,6-Dehydratase, eine Glykosyltransferase, eine Methyltransferase, eine Thymidylyltransferase, ein Zuckerbinde-protein und ein Protein mit Ähnlichkeit zu Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseproteinen. Das Synthese-Cluster wurde mit den bereits bekannten Spectinomycin-Biosynthesegenen aus S. spectabilis NRRL2494 und S. spectabilis NRRL2792 verglichen. Anhand aller verfügbaren Daten konnte ein möglicher Biosyntheseweg für Spectinomycin postuliert werden. Das für die Spectinomycin-Resistenz verantwortliche Enzym in S. flavopersicus NRRL B-2820 und S. spectabilis NRRL2494 ist eine Spectinomycin-Phosphotransferase SpcN. Das Protein aus S. spectabilis wurde in Escherichia coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mit Hilfe verschiedener Aktivitätstests wurde festgestellt, dass das Enzym mit ATP spezifisch Spectinomycin und Dihydrospectinomycin phosphoryliert. Eine Inaktivierung anderer Aminoglykosid-Antibiotika so wie eine kompetitive Inhibition des Enzyms durch die Substanzen konnte nicht nachgewiesen werden. Der KM-Wert der Spectinomycin-Phosphotransferase für Spectinomycin betrug etwa 20 µM. Die Gene für die beiden Dehydrogenasen, SpcB und SpcH, aus dem Spectinomycin-Gencluster von S. flavopersicus konnten in E. coli nur in geringer Menge exprimiert werden. Im postulierten Biosyntheseweg von Spectinomycin könnten sie mehrere Oxidations-/Reduktionsreaktionen katalysieren. Mit einigen der möglichen Substrate, myo-Inositol, scyllo-Inosose, Spectinomycin und Dihydrospectinomycin, konnte in in vitro mit NAD(P)+ bzw. NAD(P)H als Coenzym jedoch keine Aktivität festgestellt werden. Die Inaktivierung einiger Biosynthesegene über verschiedene Methoden zeigte keinen Erfolg. Dies lag zum einen daran, dass für S. flavopersicus kein zufriedenstellendes Transformationsprotokoll erstellt werden konnte, und zum anderen daran, dass durch das Fehlen von Sporen die Mutanten inhomogen waren, und in einem Myzel Wildtyp- und mutierte Sequenz parallel vorkamen. Daher konnten die Ansätze zur kombinatorischen Biosynthese, d.h. der Austausch des Methyltransferasegens spcG in S. flavopersicus gegen das Amidinotransferasegen strB1 aus S. griseus, nicht verwirklicht werden. Dagegen führte der umgekehrte Austausch von strB1 gegen spcG in S. griseus zu Mutanten, die keine antibiotische Aktivität mehr aufwiesen. Des Weiteren wurden die Netropsin-Resistenzgene netP1 und netP2 aus S. flavopersicus NRRL B-2820 isoliert. Die daraus abgeleiteten Proteine zeigten Homologie zu ABC-Transportern und wiesen charakteristische Motive dieser Proteine auf, insbesondere eine Transmembran- und eine ATP-Bindedomäne. Verschiedene Mutanten in netP1 und netP2 wurden in unterschiedlichen Tests auf ihre Netropsin-Resistenz untersucht. Aufgrund der Ergebnisse wird postuliert, dass NetP1 und NetP2 als Heterodimer wirken, aber zu einem sehr geringen Teil auch als Homodimer aktiv sind.Item Open Access Charakterisierung des Regulators ManR und die Anwendung des Mannose Expressionssystems in Bacillus subtilis(2013) Wenzel, Marian; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)In dieser Arbeit wurde der Transkriptionsaktivator ManR des Bacillus subtilis Operons für den Mannose-Metabolismus näher charakterisiert. Er besteht aus einer N-terminalen DNA-Bindedomäne, zwei Phosphotransferasesystem (PTS)-Regula-tionsdomänen (PRDs) sowie einer EII_Bgl- und einer EIIA_Fru-ähnlichen Domäne. In Analogie zu anderen PRD-haltigen Regulatoren war eine Steuerung der Aktivität von ManR durch Phosphorylierung wahrscheinlich. Die ortsgerichtete Mutagenese von ManR wurde verwendet, um die Rolle seiner konservierten Aminosäure-Reste als potentielle Phosphorylierungsstellen zu untersuchen. Die Aktivität der ManR-Mutanten wurde in vivo über beta-Galaktosidase-Aktivitätstests sowie in vitro über Gel-mobilityshift Assays nachgewiesen. Für die in vitro Versuche mussten die isolierten ManR-Moleküle zuvor mit den PTS-Komponenten HPr, EI und PEP aktiviert werden. Mutationen in der PRD1 reduzierten die Aktivität von ManR, während Mutationen in der PRD2 diese vollständig aufhoben. Die Cys415Ala-(EIIB_Bgl) und die His570Ala-Mutationen (EIIA_Fru) riefen konstitutive Aktivitäten unterschiedlichen Ausmaßes hervor, wobei letztere den größeren Einfluss hatte. Im Wildtyp und in der Cys415Ala-Mutante verringerte die Anwesenheit der PTS-Transporterdomänen EIIBAMan die DNA-Bindeaktivität von ManR signifikant. Dies war jedoch nicht bei der His570Ala-Mutante der Fall. Durch den Austausch der konservierten Amino-säuren von ManR gegen Aspartat konnte keine Phosphomimikry beobachtet werden. Die unterschiedlichen Expressionsniveaus ausgehend von den ManR-kontrollierten Promotoren von manR (PmanR) und des manPA-yjdF Operons (PmanP) konnten der unterschiedlichen 5’-untranslatierten Region der mRNAs zugeordnet werden. Über DNase I Footprinting Experimente wurden palindromähnliche Sequenzen mit einer Länge von 44 bp als ManR-Bindestellen identifiziert. Des Weiteren wurden die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten KD und die Dissoziationsraten kdiss von ManR bezüglich beider Promotorregionen bestimmt. Das Mannose-induzierbare Expressionssystem zur Produktion heterologer Proteine in B. subtilis führt zu relativ hohen Produktausbeuten, benötigt dafür jedoch hohe Mengen des teuren Induktors Mannose. Die Deletion des Gens für die Mannose-6-phosphat-Isomerase manA reduziert zwar den Induktorverbrauch, führt jedoch zur Sensitivität der Zellen gegenüber Mannose. Preisgünstiger, Mannose-haltiger Hefe-extrakt wurde als Induktoralternative getestet, zeigte jedoch nur eine geringe Induktionswirkung. Um die Produktausbeute bei gleichzeitiger Reduzierung der Induktorkosten zu steigern, wurde deshalb ein neuartiges, selbstinduzierendes Expressionssystem mit dem PTS-Transporter negativen Stamm B. subtilis TQ356 (spo0A3 delta_manP::ermC) entwickelt, bei dem Glucose die Induktion durch Katabolit-repression verhindert. Für optimale selbstinduzierende Bedingungen wurde eine Glucose-limitierende Prozessstrategie, nämlich ein Fed-Batch-Prozess, herangezogen: Die Selbstinduktion startet mit dem Beginn des Übergangs von der Batch- in die Zufütterungsphase, an dem Glucose limitierend wird, und bleibt während der gesamten Glucose-limitierten Zufütterungsphase erhalten. Dies führt im Vergleich zum Standardsystem zu einer Steigerung der Produktausbeute um fast das 3-fache. Der für das neue System verwendete, pUB110-basierte eGFP-Expressionsvektor (pMW168.1), der nach dem Rolling-Circle-Mechanismus repliziert, zeigte Instabilität bei der Segregation. Die Verwendung eines Replicons, welches nach dem Theta-Mechanismus repliziert, stabilisierte die Weitergabe an die Tochterzellen. Da mit diesem Replicon allerdings auch eine Reduzierung der Plasmidkopienzahl einher-ging, reduzierte sich entsprechend auch die Ausbeute und Produktivität des selbstinduzierenden Systems mit diesem Vektor. Selbst durch eine Erhöhung der Kopienzahl desselben Vektors wurden nicht die Werte erreicht, die mit pMW168.1 erzielt wurden. Die Anwendung der Alanin-Racemase als metabolischen Selektions-marker funktionierte zwar in Schüttelkolbenexperimenten, jedoch nicht bei der Anwendung in der Hochzelldichtefermentation. Die verwendeten Medien zeigten einen starken Einfluss auf die Expression von eGFP mit diesem System: Die Spurenelemente führten zu einem beschleunigten Wachstum, wodurch die Zellen länger in Glucose-Limitation waren und dement-sprechend mehr eGFP produzieren konnten. Der beobachtete negative Effekt der Casamino Acids auf die eGFP Expression wurde eingehend untersucht, führte jedoch zu keinem eindeutigen Resultat in Bezug auf eine bestimmte Komponente oder bestimmten Regulator.Item Open Access PRMT6 activates cyclin D1 expression in conjunction with the transcription factor LEF1(2021) Schneider, Lucas; Herkt, Stefanie; Wang, Lei; Feld, Christine; Wesely, Josephine; Kuvardina, Olga N.; Meyer, Annekarin; Oellerich, Thomas; Häupl, Björn; Seifried, Erhard; Bonig, Halvard; Lausen, JoernThe establishment of cell type specific gene expression by transcription factors and their epigenetic cofactors is central for cell fate decisions. Protein arginine methyltransferase 6 (PRMT6) is an epigenetic regulator of gene expression mainly through methylating arginines at histone H3. This way it influences cellular differentiation and proliferation. PRMT6 lacks DNA-binding capability but is recruited by transcription factors to regulate gene expression. However, currently only a limited number of transcription factors have been identified, which facilitate recruitment of PRMT6 to key cell cycle related target genes. Here, we show that LEF1 contributes to the recruitment of PRMT6 to the central cell cycle regulator CCND1 (Cyclin D1). We identified LEF1 as an interaction partner of PRMT6. Knockdown of LEF1 or PRMT6 reduces CCND1 expression. This is in line with our observation that knockdown of PRMT6 increases the number of cells in G1 phase of the cell cycle and decreases proliferation. These results improve the understanding of PRMT6 activity in cell cycle regulation. We expect that these insights will foster the rational development and usage of specific PRMT6 inhibitors for cancer therapy.
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