04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
Permanent URI for this collectionhttps://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/5
Browse
39 results
Search Results
Item Open Access Lokalisation, Speicherung und Synthese von Polyphosphat in Agrobacterium tumefaciens C58(2021) Hellenbroich, Celina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr. rer. nat.)Polyphosphat (PolyP) besitzt eine ubiquitäre Verbreitung und erfüllt, je nach Organismus, unterschiedliche und extrem vielfältige Aufgaben. In Prokaryonten liegt PolyP in sogenannten Granula vor, während in einzelligen Eukaryonten, eine Membran das PolyP von dem Cytoplasma abtrennt. Vorangegangene Arbeiten weisen darauf hin, dass sogenannte Acidocalcisomen, eben jene membranumschlossene PolyP-Speicher aus Eukaryonten, auch in dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens vorhanden sein könnten. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass sich in A. tumefaciens, wie in Bakterien übliche, PolyP-Granula befinden, die nicht von einer Membran umschlossen sind. Im weiteren Verlauf wurde die Synthese von PolyP sowie die Lokalisation der Polyphosphatkinasen (PPKs) und anderer aus der Literatur bekannter, PolyP-assoziierter Proteine untersucht. Die PPK1At stellte sich hierbei als PolyP-Syntheseenzym heraus. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der PPKs in vitro, bei der für die PPK2At, neben der Bildung von NDP und NTP, eine oligophosphorylierende Funktion bis hin zu nonaphosphorylierten Nukleosiden entdeckt wurde. Außerdem stellte sich heraus, dass das PolyP-Granulum während des Zellzyklus wanderte und vielleicht durch die PPK1At mit der DNA assoziiert sein könnte. Aufgrund dieser Erkenntnisse konnte ein Modell des PolyP-Granulums und den in dieser Arbeit identifizierten, assoziierten Proteinen erstellt werden. Eine Deletion der ppk1 hatte zudem Auswirkungen auf die Zellmorphologie, die Infektionsrate von Pflanzenzellen und die Generationszeit von A. tumefaciens.Item Open Access Microbial aldolases as C-C bonding enzymes : investigation of structural-functional characteristics and application for streoselective reactions(2006) Inoue, Tomoyuki; Sprenger, Georg (Prof. Dr.)Carbon-carbon bonding enzymes can be attractive alternatives to standard chemical methods by allowing chiral control, taking advantage of mild reaction conditions and minimizing the use of protecting groups in reactions. Fructose-6-phosphate aldolase (FSA) from Escherichia coli catalyses reversibly the cleavage of D-fructose-6-phosphate into dihydroxyacetone (DHA) and D-glyceraldehyde-3-phosphate (GAP). In addition, the enzyme creates new building blocks with 3S, 4R configuration by use of DHA as donor and various aldehydes as acceptor. The goal of this work was to investigate FSA and compare it with the transaldolase from Bacillus subtilis (TALBsu) which is similar both in sequence and structure to FSA (30% identical in amino acid residues). This should help to elucidate relationships between structure and function of both enzymes, and possible applications for FSA and TALBsu for the production of valuable sugars or sugar derivatives. Both fsa and talBsu genes were cloned with Histidine tags (6x or 10x His-tag) at the N- or C-termini to facilitate purification of the proteins. However, none of these fusion proteins (N-tagged FSA, C-tagged FSA, N-tagged TALBsu, C-tagged TALBsu) retained the complete enzyme activity. Both N-tagged FSA and TALBsu did not bind to Ni-NTA column, whereas both C-tagged enzymes bound to the resin and they could be purified. Concerning quaternary structures, N- or C-tagged TALBsu formed dimer or pentamer, while both His-tagged FSAs kept the decamer structures. This result demonstrated that His-tag would give negative influences on both FSA and TALBsu, and it was unsuitable for assay of those enzymes. In addition, FSA had different structural stability from that of TALBsu. To examine the importance of several residues at the active center in FSA, three FSA mutants (Q59E, Y131A and Y131F) were prepared so as to have the corresponding amino acid residues that are present in TALBsu and several other TALs (Gln -> Glu, Tyr -> Phe). The purified FSA Q59E protein retained approximately 66% of the wild type (WT) activity, whereas both Y131A and Y131F were completely inactive, though all three retained their decameric structures. From three-dimensional structural analysis of FSA Q59E (by the group of G. Schneider at Karolinska Institute, Stockholm), it appeared that the mutant protein's structure is identical to WT. Each mutant lost stability at high temperature and was thus denatured by heat treatment (75°C, 40min). This suggested that the Tyr131 residue has an important role for FSA activity. Indeed, a hydroxyl group at the phenyl moiety of the residue appears to be indispensable for the catalytic reaction, as the structural balance of FSA was lost by the alteration of Tyr131. Another mutant of FSA, A129S, was assayed for its synthetic capability and compared with FSA WT. Both WT and A129S catalyzed two reactions using DHA as donor with formaldehyde or glycolaldehyde as acceptor and produced S-erythrulose or D-xylulose, respectively. However, A129S showed much higher activity thus yielding larger amounts of products. On the other hand, almost no difference was observed in catalytic ability between WT and A129S for a reaction using hydroxyacetone as donor. It is supposed that a hydroxyl moiety of DHA interacts with the hydroxyl group of Ser129 in FSA A129S via a hydrogen bond and changes the affinity of the enzyme towards DHA. As further synthetic reactions, aminoaldehydes were assayed as acceptors for FSA. FSA recognized N-Cbz-3-aminopropanal with DHA and an aldol adduct (a precursor of fagomine) was produced even at 4 °C (performed by the group of P. Clapes in CSIC, Barcelona). This indicates a high utility of FSA in organic syntheses, the enzyme indeed could recognize large molecules including a benzene ring as acceptor and retains catalytic ability at rather low temperature. To evolve diverse catalytic abilities of FSA and progress further application of the enzyme, random mutagenesis was adopted by use of error prone PCR technique. As a result, various mutant proteins were acquired with the alteration of 1 to 6 residues per gene. This implies that FSA mutants can be prepared with this technique and enzyme libraries could be created. To compare FSA with TALBsu in structure, wild-type TALBsu was cloned in E. coli and purified. Three-dimensional structure analysis (by T. Sandalova in the group of G. Schneider in Karolinska Institute, Stockholm) revealed that the enzyme is a decameric protein (10 subunits of 23kDa) resulting from the dimerization of two identical pentamers. This makes TALBsu highly similar to FSA in structure with the exception only of a shorter C-terminal helix. TALBsu was tolerant of high temperature as FSA (at 75°C for 30-40min), and recognized different aldehydes or their phosphate derivatives as acceptors (Fru6P as donor). DHA was utilized as donor at a specific activity of about 10% of a reaction using Fru6P. Eight chimera proteins (chimera1-8) consisting of parts of FSA and progressively truncated TALBsu were designed and overexpressed in E. coli to probe structural determinants for each enzyme. However, several chimera samples (chimera1, 3, 6) showed only faint protein bands on SDS-PAGE and two (chimera2, 7) were not detected. All cell-free extracts of chimera proteins showed neither FSA nor TALBsu activity.Item Open Access Funktionale und strukturelle Charakterisierung von Polyphosphat und Polyphosphat-assoziierten Proteinen im ß-Proteobakterium Ralstonia eutropha H16(2022) Rosigkeit, Hanna; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Item Open Access Biologische Untersuchungen zum „lower acyclic terpene utilisation (atu) pathway“ in Pseudomonas aeruginosa und chemische Synthese wichtiger Intermediate dieses Stoffwechselweges(2012) Randel, Nadine; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Der Abbau von Citronellol und verwandten azyklischen Terpenoiden ist aufgrund einer Methylgruppe in beta-Position schwierig und nicht weit verbreitet. Die Organismen P. aeruginosa und P. citronellolis umgehen die Blockierung der beta-Oxidation durch Carboxylierung dieser Methylgruppe auf Stufe des CoenzymA-Esters 19 (Geranyl-CoA). Durch Wasseranlagerung an die Doppelbindung wird die Voraussetzung für die Abspaltung der Acetat-Funktionalität geschaffen, wobei die resultierende Verbindung 23 (7-Methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA) folgend weiter über beta-Oxidation abgebaut werden kann. •In Rohextrakten von Citronellsäure (Cs)-gewachsenen P. aeruginosa PAO1 Zellen wurde eine spezifische Geranyl-CoA Carboxylase (GCase) Aktivität von 11 ± 6 mU/mg und eine spezifische Methylcrotonyl-CoA Carboxylase (MCase) Aktivität von 47 ± 11 mU/mg bestimmt. Rohextrakte von Isovaleriansäure (Iso)-gewachsenen Zellen enthielten 54 ± 22 mU/mg MCase Aktivität. •Eine über Avidin-Chromatographie gereinigte Präparation an Biotin-Carboxylasen wies MCase Aktivität in Höhe von 4600 ± 966 mU/mg (Iso-Zellen) bzw. von 1900 ± 1200 mU/mg (Cs-Zellen) auf. GCase Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden. •Die Untereinheiten der MCase und GCase wurden rekombinant in E. coli synthetisiert und partiell gereinigt. Eine Bestimmung der Aktivität mit den selbsthergestellten CoA-Substraten konnte aber nur mit MCoA für die MCase erfolgen (2700 ± 126 mU/mg). Mit der rekombinanten GCase und GCoA 19 bzw. MCoA 29 konnte dagegen keine Aktivität bestimmt werden. •Neben den Carboxylasen wurden auch AtuD, AtuE und AtuA rekombinant exprimiert und als His-Tag Fusionsproteine aus E. coli Rohextrakten gereinigt. •Für AtuD konnte Citronellyl-CoA Dehydrogenase Aktivität sowohl über einen optischen Enzymassay (464 ± 9,9 mU/mg) als auch über den Nachweis des Reaktionsproduktes mittels HPLC-(ESI)-MS gezeigt werden. Eine Isolierung des so bereitgestellten cis-Geranyl-CoAs 19a aus dem Reaktionsansatz war jedoch nicht möglich. Auch eine Kopplung des Assays mit dem Carboxylase Assay und somit ein möglicher direkter Umsatz des gebildeten cis-GCoAs 19a über die Geranyl-CoA Carboxylase war nicht erfolgreich. •Die gereinigten rekombinanten Proteine AtuE (IHG-CoA Hydratase) und AtuA (mögliche HHG-CoA Lyase) wurden in erste Kristallisationsversuche eingesetzt. Für AtuE konnte kürzlich die Struktur mit 2,3 Å Auflösung gelöst werden. Der geplanten biochemischen Analyse beider Enzyme stand die Nichtverfügbarkeit der entsprechenden Substrate Isohexenyl-glutaconyl-CoA (IHG-CoA, 20) und 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) entgegen. Der Versuch das Substrat der Hydratase enzymatisch über die Reaktion der vorangestellten GCase zu generieren scheiterte. Im Verlauf der chemischen Arbeiten gelang es allerdings eine Vorstufe des AtuE-Substrates 94 darzustellen. Der notwendige CoA-Ester 20 wurde synthetisiert. Eine Aktivität von nativem und rekombinantem AtuE als Hydratase konnte allerdings noch nicht gezeigt werden. Eine Funktion von AtuA als vermutliche HHG-CoA Lyase konnte in dieser Arbeit aufgrund des fehlenden Substrates 21 nicht untersucht werden. •Eine Trennung des cis/trans Isomerengemisches der Geranylsäure 8 war erst nach Überführung dieser in die jeweiligen Methylester 115a bzw. 115b möglich. Beide Methylester können nun als Referenzen für folgende Metabolit-Analysen dienen. Eine Verseifungsreaktion lieferte die isomerenreinen Säuren (8a, 8b) und nach der CoA-Ester Synthese auch cis- und trans-Geranyl-CoA (19a, 19b). •Unter Verwendung des Geranylsäuremethylesters 115 konnte erstmals eine Vorstufe des Hydratase-Substrates 125 in hoher Ausbeute dargestellt werden. Eine Trennung der beiden Doppelbindungsisomere (125a, 125b) gelang über semi-präparative HPLC. Diese Methylester stehen nun ebenfalls als Referenzverbindungen zur Verfügung. Durch Verseifung konnte die racemische Dicarbonsäure 94 und nach Synthese des CoA-Esters erstmalig auch das racemische Hydratase-Substrat 20 erhalten werden. Eine mögliche stereospezifische Hydroxylierung durch das Enzym Isohexenyl-glutaconyl-CoA Hydratase (AtuE) konnte nicht untersucht werden, da die hier dargestellten Isomere der Vorstufe (125a, 125b) nicht in die CoA-Ester Synthese eingesetzt werden konnten. •Versuche eine Vorstufe des Hydratase-Produktes/Lyase-Substrates darzustellen, waren nicht erfolgreich, jedoch konnten Daten erhalten werden, welche auf eine Instabilität der Verbindung 104 als eine Vorstufe des HHG-CoAs 21 hindeuten. Dies könnte bedeuten, dass auch das Substrat 21 der Lyase selbst nicht stabil ist und somit in vivo nur als kurzlebiges Intermediat vorliegt. Das 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) ist für weitere Untersuchungen somit bislang nicht verfügbar. Im Gegensatz dazu gelang es erstmalig eine Vorstufe des Lyase-Produktes darzustellen. Dieser Methylester 133 steht nun ebenfalls als Referenzverbindung für anschließende Untersuchungen zur Verfügung.Item Open Access Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität der Nitrilase aus Pseudomonas fluorescens EBC191(2013) Sosedov, Olga; Stolz, Andreas (Prof. Dr.)Chirale 2-Hydroxycarbonsäuren und 2-Hydroxycarboxamide sind wichtige Syntheseprodukte in der organischen Chemie. Die enzymatische Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden und 2-Hydroxycarbonsäuren kann prinzipiell aus optisch aktiven Cyanhydrinen (2-Hydroxynitrilen) unter Verwendung von Nitril-Hydratasen oder Nitrilasen erfolgen. Die praktische Anwendung von Nitril-Hydratasen in der Synthese der 2-Hydroxycarboxamide wird durch Probleme bei der rekombinanten Expression, der Substratspezifität und der Cyanid-Sensitivität vieler Nitril-Hydratasen limitiert. Die beschriebenen Probleme könnten möglicherweise durch den Einsatz von Nitrilasen umgangen werden, da viele Nitrilasen neben ihren Hauptprodukten (den korrespondierenden Carbonsäuren) auch die entsprechenden Amide als Nebenprodukte bilden. Die Nitrilase aus dem Bakterium Pseudomonas fluorescens EBC191 setzt eine Vielzahl an 2-substituierten Nitrilen zu Produktgemischen mit unterschiedlichen Säure/Amid-Verhältnissen um und weist in einigen Fällen eine signifikante Nitril-Hydratase-Aktivität auf. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit diese Nitrilase mit den Methoden des Protein Engineering dahingehend modifiziert, dass sie Nitrile primär zu Amiden umsetzte. Es wurden hierbei Strategien des rationalen Protein-Designs und der gerichteten Evolution eingesetzt. Aus vorangegangenen Arbeiten waren Nitrilasevarianten bekannt, die nach Deletionen des C-terminalen Bereichs oder durch unterschiedliche Aminosäure-Austausche in der Nähe des katalytischen Zentrums erhöhte Nitril-Hydratase-Aktivitäten aufwiesen. Hierbei waren Enzymvarianten gefunden worden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 50% Mandelamid bildeten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Enzymvarianten erzeugt, die diese Mutationen in verschiedenen Kombinationen enthielten. Hierbei konnte ein kumulativer Effekt beobachtet und Enzymvarianten generiert werden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 70% Mandelamid produzierten. Im Rahmen der gerichteten Evolution der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 wurde mit Hilfe einer fehlerbehafteten PCR eine Bibliothek des modifizierten Nitrilasegens erzeugt. Ein Screening-Verfahren wurde entwickelt und optimiert, dass es ermöglichte, gesteigerte Nitril-Hydratase-Aktivitäten der Enzymvarianten in Kolonien rekombinanter Zellen über die chromogene Bildung von Fe(III)-Hydroxamat-Komplexen zu identifizieren. Die Screening-Methode basierte auf der Acyltransferase-Aktivität einer Amidase, die daher gemeinsam mit einzelnen Nitrilasevarianten in E. coli-Zellen exprimiert werden musste. Es wurden ca. 4200 Klone mit Hilfe des Screening-Verfahrens untersucht. Bei 30 Klonen zeigte die Intensität des gebildeten Fe(III)-Hydroxamat-Komplexes an, dass diese Klone Enzymvarianten mit signifikant höheren Nitril-Hydratase-Aktivitäten als der Wildtyp enthielten. Anschließend wurde der Umsatz von (R,S)-Mandelonitril durch diese Klone mit Hilfe der HPLC analysiert. Hierbei wurden Enzymvarianten gefunden, die aus (R,S)-Mandelonitril bis zu 90% Mandelamid bildeten. Dies bedeutete im Vergleich zum Wildtyp eine annähernd 5-fache Steigerung der Nitril-Hydratase-Aktivität. Die Nitrilase-Gene der im Rahmen der Zufallsmutagenese erhaltenen positiven Mutanten wurden sequenziert und eine Reihe von Aminosäure-Austauschen identifiziert, die zu einer erhöhten Amidbildung führten und die noch nicht aus den früheren Arbeiten bekannt waren. Hierbei wurde gezeigt, dass insbesondere der Austausch eines Tryptophan-Rests in der Position 188 der Nitrilase zu Enzymvarianten mit sehr hohen Nitril-Hydratase-Aktivitäten führte. Nach einer Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Enzymvarianten erhalten, die ca. 94% Mandelamid im Produktgemisch aufwiesen. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit gelang es somit, eine beinahe vollständige funktionelle Umwandlung der Nitrilase aus P. fluorescens EBC191 in eine Nitril-Hydratase zu erreichen. Die so erhaltenen Nitrilasevarianten wurden in enzymatischen Kaskadenreaktionen zur Synthese von optisch aktiven 2-Hydroxycarboxamiden eingesetzt. Hierzu wurden rekombinante E. coli Ganzzell-Katalysatoren konstruiert, die eine Nitrilasevariante mit gesteigerter Nitril-Hydratase-Aktivität zusammen mit einer (S)-spezifischen Oxynitrilase aus der Cassava-Pflanze (Manihot esculenta) oder einer (R)-spezifischen Oxynitrilase aus der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) co-exprimierten. Die so erhaltenen Ganzzell-Katalysatoren setzten in wässrigen schwach sauren Puffer-Lösungen Benzaldehyd und Cyanid zu (S)- oder (R)-Mandelamid um. Hierbei wurden mit beiden "bienzymatischen" Ganzzell-Katalysatoren hohe Produktausbeuten und Enantiomerenüberschüsse > 90% erzielt. Die so erzeugten Ganzzell-Katalysatoren stellen eine synthetisch interessante Möglichkeit zur Herstellung verschiedenster optisch aktiver 2-Hydroxycarboxamide dar.Item Open Access Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol: Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho(2002) Germer, Andrea; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Zur biotechnologischen Produktion der Bulkchemikalie Phenol wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Mutante des Bakterienstammes P. putida Idaho konstruiert, mit welcher aus Toluol Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol als Precursor für die weitere Umsetzung zu Phenol hergestellt werden sollte. In P. putida Idaho ist das gewünschte Produkt Metabolit des Abbauweges von Toluol. Im Wildtypstamm P. putida Idaho wird Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durch zwei Dehydrogenasen, die in verschiedenen Genclustern codiert sind, zu Brenzcatechin umgesetzt. Die Toluat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase XylL, die im meta-Operon codiert ist, wurde durch eine Deletion im Gen xylL inaktiviert, in Gen benD der Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase des b-Ketoadipatweges wurde zusätzlich zu einer Deletion ein Antibiotikaresistensmarker, das W-Fragment, eingefügt. Mit dieser Mutante P. putida Idaho BDH2 wurden Umsatzexperimente von Toluol zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Mutante trotz Inaktivierung der beiden Gene, welche das Produkt in Wildtypstamm weiter abbauen, immer noch in der Lage ist, Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen. Aus dem angebotenen Toluol entstand außerdem nur 25-40 % des erwarteten Produktes, das nach etwa 4 Tagen unter weiterer Bildung von Biomasse wieder abgebaut wurde. Wurde statt Toluol Benzylalkohol oder Benzoat angeboten, wurde Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol zu nahezu 100 % gebildet. Auch während des Umsatzes dieser beiden Substrate konnte eine sehr schwache Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Wie im Ansatz mit Toluol wurde auch in diesen Ansätzen das gebildete Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol nach einigen Tagen unter Wachstum der Zellen wieder abgebaut. Durch Enzymtests mit Rohextrakten der Doppelmutanten von P. putida Idaho konnte eine sehr schwache aber signifikante Aktivität eines Enzyms, das Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol umsetzen kann, nachgewiesen werden, was den Abbau des gebildeten Produktes erklärt. Ob die Bilanzlücke bei der Bildung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol allein dieser Aktivität zugrunde liegt, ist nicht geklärt. Ein zusätzlicher Abbauweg von Toluol in P. putida Idaho der nicht über die Metabolite Benzylalkohol und Benzoat geht, konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Mutante P. putida Idaho BDH2, deren Biomasse mit dem Substrat Glucose produziert wurde, sich nur sehr schlecht mit Toluol induzieren ließ. Eine technische Produktion von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol mit P .putida Idaho ist, abgesehen vom unvollständigen Umsatz von Toluol ausgehend, weiterhin problematisch. Die Sequenzierung der beiden Gencluster mit den Dehydrogenasen zeigte, dass beide für den Umsatz zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol erforderlichen Dioxygenasen vorhanden waren. Die Gencluster aus P. putida Idaho zeigten Abweichungen von den sonst fast identischen Clustern, nämlich dem meta-Operon aus pWW0 und dem ß-Ketoadipatweg aus P. putida PRS2000. Diese Abweichungen könnten Hinweise auf eine andersartige Regulation für den Aromatenabbau als in den Wegen aus pWW0 oder P. putida PRS2000 bergen. Auch ist die Rekrutierung einer cis-1,2-Dihydrodiol-Dehydrogenase aus einem der beiden Gencluster an einen anderen Lokus des Chromosoms aus P. putida Idaho nicht ausgeschlossen.Item Open Access Das Abbauverhalten des PHB-Granulumkomplexes aus Ralstonia eutropha : Charakterisierung mit Hilfe neu entwickelter Methoden(2009) Gebauer, Birgit; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Kohlenstoff zu speichern, wenn aus Mangel an anderen essentiellen Substraten kein Wachstum möglich ist. Dies geschieht intrazellulär über amorphe Polyester wie Poly(3-hydroxybutyrat), PHB, die in Form von Granula eingelagert werden. Ist die Nährstoffversorgung für Wachstum und Vermehrung wieder im Gleichgewicht, kann der Kohlenstoffspeicher mit Hilfe von intrazellulären Depolymerasen (PhaZ) abgebaut und genutzt werden. Für den Modellorganismus Ralstonia eutropha H16 wurden bisher sieben intrazelluläre Depolymerasen und zwei Oligomerhydrolasen postuliert. Nur zwei der Depolymerasen konnten jedoch auf der Oberfläche der Granula nachgewiesen werden: PhaZa1 und PhaZd. Zusammen mit den Granula-gebundenen Phasin-Proteinen (PhaP), der PHB-Synthase (PhaC) und anderen Proteinen bilden sie ein komplexes System, das man durchaus als Organell bezeichnen kann (Jendrossek 2009). Diese Arbeit charakterisiert erstmalig die Depolymerase-Aktivität des gesamten Granulumkomplexes, indem bekannte Techniken und neue Methoden kombiniert wurden.Item Open Access Identifizierung neuer Proteine des Polyphosphat Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16(2017) Tumlirsch, Tony; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Item Open Access Identifizierung und Funktionsanalyse neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16(2013) Pfeiffer, Daniel; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Poly(3-hydroxybuttersäure) (PHB) spielt eine wichtige Rolle als Kohlenstoff- und Energiespeicher in zahlreichen Mikroorgansimen. Intrazellulär gebildetes PHB liegt hierbei in Form von so genannten nativen PHB-Granula vor. An der Oberfläche der PHB-Granula sind unter anderem Proteine gebunden, welche für deren Synthese (PHB-Synthase, PhaC) oder Abbau (PHB-Depolymerase, PhaZ) verantwortlich sind oder das Oberfläche/Volumenverhältnis der Granula regulieren (Phasine, PhaP). Vorangegangene Arbeiten mit Ralstonia eutropha - dem Modellorganismus der PHB-Speicherung - zeigten, dass PHB-Granula in der frühen Phase ihrer Bildung nicht zufällig verteilt in der Zelle vorliegen, sondern gehäuft an den Zellpolen oder der inneren Seite der Cytoplasmamembran lokalisiert sind. Dies ließ eine spezifische Interaktion zwischen PHB-Granula-assoziierten Proteinen mit unbekannten Zielstrukturen in der Zellperipherie vermuten. Diese Annahme wurde durch die in der Literatur beschriebenen cytoskelettartigen Strukturen auf der Oberfläche nativer PHB-Granula unterstützt. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Proteine, welche spezifisch mit der PHB-Synthase oder anderen Oberflächenproteinen der PHB-Granula (z.B. Phasinen) interagieren, durch einen bakteriellen Two-Hybrid Assay identifiziert und anschließend auf ihre Beteiligung an der PHB-Granulabildung überprüft. Zur Identifizierung neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes wurden zudem weitere Methoden eingesetzt. PHB-Granula-assoziierte Proteine wurden ferner über eine Proteomanalyse isolierter PHB-Granula sowie eine Motivsuche nach Konsensussequenzen von Phasinen identifiziert. Im Zuge dieser Experimente konnten die vier bisher nicht beschriebene Proteine PhaP5 (H16_B1934), PhaP6 (H16_B1988), PhaP7 (H16_B2326) und PhaM (H16_A0141) identifiziert werden. Für diese Proteine konnte gezeigt werden, dass sie Phasin-ähnliche Eigenschaften aufweisen und mit den PHB-Granula assoziiert vorliegen. Insbesondere für PhaM und PhaP5 wurde nachgewiesen, dass diese Anzahl, Oberfläche/Volumen-Verhältnis und Lokalisierung der PHB-Granula regulieren können. PhaM war in der Lage mit dem Schlüsselenzym der PHB-Bildung der PHB-Synthase (PhaC1) zu wechselwirken. Weitere Protein-Protein-Interaktionen konnten zwischen PhaM und PhaP5 sowie zwischen PhaP5 und verschiedenen anderen Phasinen, dem Regulator der Phasin-Expression (PhaR) sowie der PHB-Depolymerase PhaZa1 nachgewiesen werden. Eine Überexpression von PhaM führte zu einer stark erhöhten Anzahl kleiner PHB-Granula, welche nahezu ausschließlich mit dem Nukleoid assoziiert waren. Bei Überexpression von PhaP5 waren die PHB-Granula hingegen überwiegend an den Zellpolen lokalisiert und ein Kontakt zum Nukleoid war nicht mehr nachweisbar. Zellen einer phaM-Deletionsmutante waren zudem in einer gleichmäßigen Aufteilung der Granula auf die Tochterzellen gestört und bildeten meist nur ein sehr großes PHB-Granulum. PhaM konnte aufgrund charakteristischer Alanine, Proline und Lysine (AAKP-Motive) im C-terminalen Bereich seiner Aminosäuresequenz den Histon H1-ähnlichen Proteinen zugeordnet werden. PhaM war in der Lage sowohl in vitro als auch in vivo unspezifisch an DNA (Nukleoid) zu binden. Aufgrund dieser Eigenschaften kann PhaM PHB-Granula physisch mit dem Nukleoid verknüpfen. Hierdurch wird gewährleistet, dass diese im Zuge der Chromosomensegregation und Zellteilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden. Anhand dieser neuen Erkenntnisse wurde ein Modell zur Verteilung der PHB-Granula während der Zellteilung entwickelt. In weiteren Experimenten wurde die Lokalisierung der PHB-Synthase untersucht und so neue Erkenntnisse zum Entstehungsort der PHB-Granula gewonnen. Dabei konnte gezeigt werden, dass PHB-Granula vermutlich nicht an der Zellmembran gebildet werden („Budding-Modell“). Die PHB-Synthase liegt hingegen ebenfalls über ihre Wechselwirkung mit PhaM an das Nukleoid gebunden vor. Das Nukleoid stellt damit den Bildungsort sowie Verankerungspunkt der PHB-Granula in der Zelle dar.Item Open Access Biotechnological production of aromatic amines and aromatic alcohols by recombinant Escherichia coli strains(2019) Mohammadi Nargesi, Behrouz; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Aromatic amine (AA) are an important group of industrial chemicals which are widely used for technical and pharmaceutical applications and described as the building block of drugs (Bedair et al. 2006; Jobdevairakkam and Velladurai 2009; Sacco and Bientinesi 2016), antibiotics, plastics and aromatic polymers (Arora 2015; Masuo et al. 2016; Tsuge et al. 2016; Kawasaki et al. 2018). In addition, aromatic alcohols, as other valuable compounds, are widely used in manufacturers of perfumes, cosmetics, and foods, and pharmaceutical industry (Etschmann et al. 2002; Miró-Casas et al. 2003; Bai et al. 2014). Most of the AAs and aromatic alcohols are chemically synthesized from petroleum sources and considered as “unnatural”, which are inappropriate to make cosmetic, drugs or food ingredient, thereby natural microbial biosynthesis of these valuable compounds in E.coli would be an alternative approach. In the first part of this study, a de-novo biosynthesis pathway was established for high titer production of three aromatic amines, para-amino-L-phenylalanine (L-PAPA), para-amino-phenylethanol (PAPE) and para-amino-phenylacetic acid (4-APA) from glucose/glycerol via genetic modification of the shikimate pathway in recombinant E. coli (Mohammadi et al. 2018 and 2019). To generate a platform strain for L-PAPA production from shikimate pathway, the genes pabAB from Corynebacterium glutamicum (Kozak 2006), papB and papC from Streptomyces venezuelae (Blanc et al. 1997; He et al. 2001; Mehl et al. 2003) were heterologously overexpressed from plasmid in E. coli FUS4.7R (Gottlieb et al. 2014). Then, the metabolic flux was directed to PAPE and 4-APA production via overexpression of aro10 from Saccharomyces cerevisiae (Kneen et al. 2011; Vuralhan et al. 2003 and 2005) and both aro10 and feaB in E. coli FUS4BCR, respectively. The engineered E. coli strains were cultured in the shake-flasks with fed batch condition and investigated for L-PAPA, PAPE and 4-APA production by HPLC and LC-MS. In the simple shake flask experiments, the plasmid based strain produced L-PAPA as high as 0.534 ± 0.024 g l-1 from 5 ± 0.24 g l-1 glycerol. Also, introduction of aro10 and yahK in L-PAPA producing strain resulted in 0.526 ± 0.025 g l-1 PAPE. Furthermore, by introducing feaB into the PAPE- producing strain, 4-APA was obtained with a titer of 0.458 ± 0.014 g l-1. Last but not least, by further strain improvement and optimizing growth condition via glucose/glycerol feed strategy, an increasing titer of L-PAPA, PAPE and 4-APA approximately 5.5 ± 0.4 g l-1, 2.5 ± 0.15 g l-1 and 3.4 ± 0.3 g l-1 were obtained, respectively. In subsequent fed-batch cultivation with a final volume of 12.2 l and the carbon sources glycerol, a final L-PAPA-titer of 16.8 g l-1 was obtained. This equals a yield of 0.13 L-PAPA / glycerol (g g-1) and a space-time-yield of 0.22 g l-1 h-1 L-PAPA formation over the whole process. Furthermore, a de-novo biosynthesis pathway for the production of 2-Phenylethanol (2-PE)/tyrosol from glucose with genetically engineered E. coli strains without additional L-phenylalanine/ L-tyrosine as supplement was demonstrated. Starting from chorismate, which is the direct precursor of phenylpyruvate (PP)/ 4-Hydroxyphenylpyruvate (4-HPP), an artificial Ehrlich biosynthesis pathway was created (Etschmann et al. 2002) toward 2-PE or tyrosol. To generate a platform strain for production of 2-PE and tyrosol from shikimate pathway, the genes pheA or tyrA encoding proteins chorismate mutase/prephenate dehydratase or prephenate dehydrogenase (feedback resistance variant, Rüffer et al. 2004; Gottlieb et al. 2014), respectively, were cloned and subsequently overexpressed from plasmid in E. coli. In the next step, the metabolic flux was directed to 2-PE and tyrosol production via overexpression of aro10 encoding phenylpyruvate decarboxylase from S. cerevisiae. Furthermore, in order to enhance the flux toward downstream 2-PE/tyrosol pathway, the relevant genes of three rate limiting steps including aroF, aroB and aroL were subcloned and overexpressed from plasmid. Upon simple batch cultivation, these strains separately yielded 369 ± 25 mg l-1 2-PE and 437 ± 33 mg l-1 tyrosol from 4.5 ± 0.21 g l-1 glucose. Final titer in the shake flask was further improved through glucose fed-batch fermentation to 1.75 ± 0.12 g l-1 2-PE and 1.68 ± 0.19 g l-1 tyrosol. The subsequent significant enhancement of 2-PE/tyrosol production occurred through employing in situ product removal (ISPR) techniques including two-phase extraction by different organic compounds (Etschmann et al. 2002; Rüffer et al. 2004; Schügerl and Hubbuch 2005; Hu and Xu 2011; Chreptowicz et al. 2018). In subsequent glucose-limited fed-batch cultivation with a benchtop bioreactor system (0.75 l), a final 2-PE and tyrosol-titer of 3.1 g l-1 and 3.6 g l-1 reached with a yield and a space-time-yield of 0.07 g g-1 and 0.03 g l-1 h-1 for 2-PE and 0.08 g g-1 and 0.04 g l-1 h-1 for tyrosol, respectively. These works have successfully demonstrated the possibility of synthesizing of several invaluable fine chemicals in whole-cell system using plasmid based-E.coli strains. In addition, the titter and yield previously reported in the biosynthesis of aromatic amines (L-PAPA, PAPE or 4-APA) or even aromatic alcohols (2-PE or tyrosol) have been significantly improved in this study.