04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Microbial aldolases as C-C bonding enzymes : investigation of structural-functional characteristics and application for streoselective reactions(2006) Inoue, Tomoyuki; Sprenger, Georg (Prof. Dr.)Carbon-carbon bonding enzymes can be attractive alternatives to standard chemical methods by allowing chiral control, taking advantage of mild reaction conditions and minimizing the use of protecting groups in reactions. Fructose-6-phosphate aldolase (FSA) from Escherichia coli catalyses reversibly the cleavage of D-fructose-6-phosphate into dihydroxyacetone (DHA) and D-glyceraldehyde-3-phosphate (GAP). In addition, the enzyme creates new building blocks with 3S, 4R configuration by use of DHA as donor and various aldehydes as acceptor. The goal of this work was to investigate FSA and compare it with the transaldolase from Bacillus subtilis (TALBsu) which is similar both in sequence and structure to FSA (30% identical in amino acid residues). This should help to elucidate relationships between structure and function of both enzymes, and possible applications for FSA and TALBsu for the production of valuable sugars or sugar derivatives. Both fsa and talBsu genes were cloned with Histidine tags (6x or 10x His-tag) at the N- or C-termini to facilitate purification of the proteins. However, none of these fusion proteins (N-tagged FSA, C-tagged FSA, N-tagged TALBsu, C-tagged TALBsu) retained the complete enzyme activity. Both N-tagged FSA and TALBsu did not bind to Ni-NTA column, whereas both C-tagged enzymes bound to the resin and they could be purified. Concerning quaternary structures, N- or C-tagged TALBsu formed dimer or pentamer, while both His-tagged FSAs kept the decamer structures. This result demonstrated that His-tag would give negative influences on both FSA and TALBsu, and it was unsuitable for assay of those enzymes. In addition, FSA had different structural stability from that of TALBsu. To examine the importance of several residues at the active center in FSA, three FSA mutants (Q59E, Y131A and Y131F) were prepared so as to have the corresponding amino acid residues that are present in TALBsu and several other TALs (Gln -> Glu, Tyr -> Phe). The purified FSA Q59E protein retained approximately 66% of the wild type (WT) activity, whereas both Y131A and Y131F were completely inactive, though all three retained their decameric structures. From three-dimensional structural analysis of FSA Q59E (by the group of G. Schneider at Karolinska Institute, Stockholm), it appeared that the mutant protein's structure is identical to WT. Each mutant lost stability at high temperature and was thus denatured by heat treatment (75°C, 40min). This suggested that the Tyr131 residue has an important role for FSA activity. Indeed, a hydroxyl group at the phenyl moiety of the residue appears to be indispensable for the catalytic reaction, as the structural balance of FSA was lost by the alteration of Tyr131. Another mutant of FSA, A129S, was assayed for its synthetic capability and compared with FSA WT. Both WT and A129S catalyzed two reactions using DHA as donor with formaldehyde or glycolaldehyde as acceptor and produced S-erythrulose or D-xylulose, respectively. However, A129S showed much higher activity thus yielding larger amounts of products. On the other hand, almost no difference was observed in catalytic ability between WT and A129S for a reaction using hydroxyacetone as donor. It is supposed that a hydroxyl moiety of DHA interacts with the hydroxyl group of Ser129 in FSA A129S via a hydrogen bond and changes the affinity of the enzyme towards DHA. As further synthetic reactions, aminoaldehydes were assayed as acceptors for FSA. FSA recognized N-Cbz-3-aminopropanal with DHA and an aldol adduct (a precursor of fagomine) was produced even at 4 °C (performed by the group of P. Clapes in CSIC, Barcelona). This indicates a high utility of FSA in organic syntheses, the enzyme indeed could recognize large molecules including a benzene ring as acceptor and retains catalytic ability at rather low temperature. To evolve diverse catalytic abilities of FSA and progress further application of the enzyme, random mutagenesis was adopted by use of error prone PCR technique. As a result, various mutant proteins were acquired with the alteration of 1 to 6 residues per gene. This implies that FSA mutants can be prepared with this technique and enzyme libraries could be created. To compare FSA with TALBsu in structure, wild-type TALBsu was cloned in E. coli and purified. Three-dimensional structure analysis (by T. Sandalova in the group of G. Schneider in Karolinska Institute, Stockholm) revealed that the enzyme is a decameric protein (10 subunits of 23kDa) resulting from the dimerization of two identical pentamers. This makes TALBsu highly similar to FSA in structure with the exception only of a shorter C-terminal helix. TALBsu was tolerant of high temperature as FSA (at 75°C for 30-40min), and recognized different aldehydes or their phosphate derivatives as acceptors (Fru6P as donor). DHA was utilized as donor at a specific activity of about 10% of a reaction using Fru6P. Eight chimera proteins (chimera1-8) consisting of parts of FSA and progressively truncated TALBsu were designed and overexpressed in E. coli to probe structural determinants for each enzyme. However, several chimera samples (chimera1, 3, 6) showed only faint protein bands on SDS-PAGE and two (chimera2, 7) were not detected. All cell-free extracts of chimera proteins showed neither FSA nor TALBsu activity.Item Open Access Herstellung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol: Konstruktion und Charakterisierung einer Mutante des Lösungsmittel tolerierenden Pseudomonas putida Idaho(2002) Germer, Andrea; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Zur biotechnologischen Produktion der Bulkchemikalie Phenol wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Mutante des Bakterienstammes P. putida Idaho konstruiert, mit welcher aus Toluol Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol als Precursor für die weitere Umsetzung zu Phenol hergestellt werden sollte. In P. putida Idaho ist das gewünschte Produkt Metabolit des Abbauweges von Toluol. Im Wildtypstamm P. putida Idaho wird Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durch zwei Dehydrogenasen, die in verschiedenen Genclustern codiert sind, zu Brenzcatechin umgesetzt. Die Toluat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase XylL, die im meta-Operon codiert ist, wurde durch eine Deletion im Gen xylL inaktiviert, in Gen benD der Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol-Dehydrogenase des b-Ketoadipatweges wurde zusätzlich zu einer Deletion ein Antibiotikaresistensmarker, das W-Fragment, eingefügt. Mit dieser Mutante P. putida Idaho BDH2 wurden Umsatzexperimente von Toluol zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Mutante trotz Inaktivierung der beiden Gene, welche das Produkt in Wildtypstamm weiter abbauen, immer noch in der Lage ist, Toluol als Wachstumssubstrat zu nutzen. Aus dem angebotenen Toluol entstand außerdem nur 25-40 % des erwarteten Produktes, das nach etwa 4 Tagen unter weiterer Bildung von Biomasse wieder abgebaut wurde. Wurde statt Toluol Benzylalkohol oder Benzoat angeboten, wurde Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol zu nahezu 100 % gebildet. Auch während des Umsatzes dieser beiden Substrate konnte eine sehr schwache Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Wie im Ansatz mit Toluol wurde auch in diesen Ansätzen das gebildete Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol nach einigen Tagen unter Wachstum der Zellen wieder abgebaut. Durch Enzymtests mit Rohextrakten der Doppelmutanten von P. putida Idaho konnte eine sehr schwache aber signifikante Aktivität eines Enzyms, das Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol umsetzen kann, nachgewiesen werden, was den Abbau des gebildeten Produktes erklärt. Ob die Bilanzlücke bei der Bildung von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol aus Toluol allein dieser Aktivität zugrunde liegt, ist nicht geklärt. Ein zusätzlicher Abbauweg von Toluol in P. putida Idaho der nicht über die Metabolite Benzylalkohol und Benzoat geht, konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass die Mutante P. putida Idaho BDH2, deren Biomasse mit dem Substrat Glucose produziert wurde, sich nur sehr schlecht mit Toluol induzieren ließ. Eine technische Produktion von Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol mit P .putida Idaho ist, abgesehen vom unvollständigen Umsatz von Toluol ausgehend, weiterhin problematisch. Die Sequenzierung der beiden Gencluster mit den Dehydrogenasen zeigte, dass beide für den Umsatz zu Benzoat-cis-1,2-dihydrodiol erforderlichen Dioxygenasen vorhanden waren. Die Gencluster aus P. putida Idaho zeigten Abweichungen von den sonst fast identischen Clustern, nämlich dem meta-Operon aus pWW0 und dem ß-Ketoadipatweg aus P. putida PRS2000. Diese Abweichungen könnten Hinweise auf eine andersartige Regulation für den Aromatenabbau als in den Wegen aus pWW0 oder P. putida PRS2000 bergen. Auch ist die Rekrutierung einer cis-1,2-Dihydrodiol-Dehydrogenase aus einem der beiden Gencluster an einen anderen Lokus des Chromosoms aus P. putida Idaho nicht ausgeschlossen.Item Open Access Das Abbauverhalten des PHB-Granulumkomplexes aus Ralstonia eutropha : Charakterisierung mit Hilfe neu entwickelter Methoden(2009) Gebauer, Birgit; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Kohlenstoff zu speichern, wenn aus Mangel an anderen essentiellen Substraten kein Wachstum möglich ist. Dies geschieht intrazellulär über amorphe Polyester wie Poly(3-hydroxybutyrat), PHB, die in Form von Granula eingelagert werden. Ist die Nährstoffversorgung für Wachstum und Vermehrung wieder im Gleichgewicht, kann der Kohlenstoffspeicher mit Hilfe von intrazellulären Depolymerasen (PhaZ) abgebaut und genutzt werden. Für den Modellorganismus Ralstonia eutropha H16 wurden bisher sieben intrazelluläre Depolymerasen und zwei Oligomerhydrolasen postuliert. Nur zwei der Depolymerasen konnten jedoch auf der Oberfläche der Granula nachgewiesen werden: PhaZa1 und PhaZd. Zusammen mit den Granula-gebundenen Phasin-Proteinen (PhaP), der PHB-Synthase (PhaC) und anderen Proteinen bilden sie ein komplexes System, das man durchaus als Organell bezeichnen kann (Jendrossek 2009). Diese Arbeit charakterisiert erstmalig die Depolymerase-Aktivität des gesamten Granulumkomplexes, indem bekannte Techniken und neue Methoden kombiniert wurden.Item Open Access Degradation of 2-bromo-, 2-chloro- and 2-fluorobenzoate by Pseudomonas putida CLB 250(1989) Engesser, Karl-Heinrich; Schulte, P.Pseudomonas putida strain CLB 250 (DSM 5232) utilized 2-bromo-, 2-chloro- and 2-fluorobenzoate as sole source of carbon and energy. Degradation is suggested to be initiated by a dioxygenase liberating halide in the first catabolic step. After decarboxylation and rearomatization catechol is produced as a central metabolite which is degraded via the ortho-pathway. After inhibition of ring cleavage activities with 3-chlorocatechol, 2-chlorobenzoate was transformed to catechol in nearly stoichiometric amounts. Other ortho-substituted benzoates like anthranilate and 2-methoxybenzoate seem to be metabolized via the same route.Item Open Access Herstellung von 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat aus Toluol : Konstruktion von Stämmen für die selektive Hydroxylierung(2003) Gittinger, Simone; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren zur selektiven Hydroxylierung von Kohlenwasserstoffen zu entwickeln. Als Beispiel für einen derartigen Prozess sollte die Herstellung von Phenol aus Toluol ermöglicht werden. Für die Produktion von Phenol aus Toluol ist ein zweistufiges Verfahren notwendig: Die Biotransformation von Toluol zu Benzoatdihydrodiol (cis-Cyclohexa-3,5-dien-1,2-diol-1-carboxylat oder 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat) und die anschließende mit Säure katalysierte Umsetzung von Benzoatdihydrodiol zu Phenol. Für die Bereitstellung eines geeigneten Biokatalysators sollten in einen toluoltoleranten Stamm, der weder Toluol noch Benzoatdihydrodiol verwerten konnte, die erforderlichen Gene auf einem Transposon oder Plasmid integriert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein geeigneter toluoltoleranter Bakterienstamm isoliert werden konnte, wurden die Gene für die Toluoloxidation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Von diesen Stämmen war bekannt, dass sie im Stoffwechsel von Benzoat auf der Stufe des Benzoatdihydrodiols bereits blockiert waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Stämme Toluol nicht oxidierten. Allerdings zeigten sie nur eine sehr geringe Toleranz gegenüber Toluol. Die zusätzlichen Gene für die Transformation von Toluol zu Benzoat wurden mit Hilfe des rekombinanten Plasmids pCK05 (Panke et al., 1998) übertragen. Dieses Plasmid trägt auf einem Transposon die erforderlichen Struktur- und Regulatorgene aus dem TOL-Plasmid pWW0 von P. putida mt-2. Mittels Konjugation konnte die Genkassette stabil in das bakterielle Chromosom von R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 integriert werden. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten Toluol und Benzylalkohol zu Benzoatdihydrodiol. Dagegen setzten Transkonjuganten von R. eutropha B9 nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Zusätzlich wurden die Gene für die Oxidation von Toluol zu Benzoat extrachromosomal auf einem Plasmid in die beiden Stämme eingebracht. Dazu wurde die Genkassette in "broad-host-range" Vektoren kloniert. Die konstruierten Plasmide pBBSG1 und pMMSG6 wurden ebenfalls mittels Konjugation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Transkonjuganten von R. eutropha B9 setzten wiederum nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten zwar Toluol zu Benzoatdihydrodiol, allerdings konnten im Vergleich zu den Transkonjuganten mit den zusätzlichen Genen im Chromosom keine besseren Umsatzraten erreicht werden. Die Expression der Gene wurde auch in E. coli DH5a untersucht. Hierfür mussten neben den Genen der Enzyme für die Oxidation von Toluol zu Benzoat auch die Gene für die Benzoat-Dioxygenase kloniert werden. In dieser Arbeit gelang es nicht, die Gene für die Enzyme des vollständigen Abbauweges auf einem Plasmid bereitzustellen. Die Gene für die Oxidation von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol konnten aber separat auf einem weiteren Plasmid (pBBSG2) kloniert werden. Somit standen zwei verschiedene rekombinante E. coli DH5a-Stämme zur Verfügung: einer für die Transformation von Toluol zu Benzoat und ein weiterer für den Umsatz von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol. Eine Mischkultur aus beiden rekombinanten Stämmen setzte Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Des weiteren war es gelungen, die beiden Plasmide zusammen in einen Stamm (ebenfalls E. coli DH5a) zu transformieren. Auch mit diesem Konstrukt konnte Toluol zu Benzoatdihydrodiol umgesetzt werden. Die geringe Toluoltoleranz von P. putida U-JT103 und E. coli DH5a während des Umsatzes von Toluol zu Benzoatdihydrodiol führte zu einer hohen Instabilität der konstruierten Stämme. Die Ausbeuten an Benzoatdihydrodiol lagen zwischen 70 und 99 %. P. putida U_TP10 (Transkonjugante mit der Genkassette im Chromosom) wurde für einen möglichen Einsatz als Biokatalysator in einem großtechnischen Prozess weiter untersucht. Mit den Ergebnissen konnte eine volumetrische Reaktorproduktivität von 0,02 mol×l-1×h-1 abgeschätzt werden. Aufgrund der geringen Produktivität und hohen Instabilität des Biokatalysators ist ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Massenprodukts Phenol gegenüber den etablierten chemischen Verfahren aus wirtschaftlicher Sicht nicht konkurrenzfähig. Allerdings können die konstruierten Stämme für die Produktion von chiralen Diolen eingesetzt werden, die chemisch nur mit unvergleichlich hohem Aufwand herzustellen sind.Item Open Access Enrichment of dibenzofuran utilizing bacteria with high co-metabolic potential towards dibenzodioxin and other anellated aromatics(1989) Strubel, Volker; Rast, Hans G.; Fietz, Walter H.; Knackmuss, Hans-Joachim; Engesser, Karl-HeinrichDibenzofuran degrading bacteria were enriched from various environmental sources. A mutualistic mixed culture of strain DPO 220 and strain DPO 230 was characterized. Strain DPO 220 alone showed limited growth with dibenzofuran as sole source of carbon and energy (td ≥ 4.5 h). A labile degradation product, C12H10O5, and salicylate were isolated from the culture fluid. Salicylate was found to be a central intermediate of DBF-degradation.Strain DPO 220 co-metabolized a wide range of anellated aromatics as well as heteroaromatics. High rates of co-oxidation of dibenzodioxin demonstrate analogue-enrichment to be a powerful technique for selecting enzymatic activities for otherwise non-degradable substrates.Item Open Access Enzyme, Gene und Mechanismen des oberen Abbauweges von Pikrinsäure und 2,4-Dinitrophenol durch Nocardioides simplex FJ2-1A(2001) Ebert, Sybille; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Der Bakterienstamm Nocardioides simplex FJ2-1A baut 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) und Pikrinsäure unter aeroben Bedingungen vollständig ab. Hydrid wird auf den aromatischen Ring des Nitroaromaten übertragen. Dabei entsteht der jeweilige Hydrid-Meisenheimer-Komplex als Produkt. Diese initiale Reduktion wird von einem Enzymsystem katalysiert. Koenzym F420, welches als methanogener Kofaktor bekannt ist, wurde als Mediator der Hydridübertragung identifiziert. Von NADPH wird Hydrid mittels einer NADPH-abhängigen F420-Reduktase auf Koenzym F420 übertragen. Der sich anschließende Hydridtransfer auf das aromatische System des Nitroaromaten wird durch eine Hydridtransferase katalysiert. Die N-terminalen Sequenzen der Proteine dienten zur Ableitung von Oligonukleotiden für die Herstellung einer Sonde mittels PCR. Ein 7.2 kb großes DNA Fragment, das die Gene der beiden Enzyme beinhaltet, wurde isoliert und sequenziert. Bei Datenbankvergleichen zeigt die F420-Reduktase Ähnlichkeiten zu F420-abhängigen NADP+-Reduktasen aus Archaea und Streptomyceten. Die Hydridtransferase ist N5,N10-Methylen-tetrahydromethanopterin-Reduktasen ähnlich. Der Dihydrid-Komplex von Pikrat wurde als Produkt einer zweifachen Hydridübertragung auf das aromatische Ringsystem von Pikrat durch das Enzymsystem identifiziert. Der Dihydrid Komplex des Pikrats wurde 1H- und 13C-NMR spektroskopisch untersucht. Er wird enzymatisch unter Elimination von Nitrit und der Bildung des Hydrid-Meisenheimer-Komplexes von 2,4-DNP umgesetzt. Die nitriteliminierende Aktivität wurde mit FPLC angereichert. Als Produkt der Reduktion von 2,4-DNP durch das Hydrid übertragende Enzymsystem entsteht der korrespondierende Hydrid-Meisenheimer-Komplex. Als Folge dieser Untersuchungen ergibt sich für Nocardioides simplex FJ2-1A ein konvergenter Abbauweg von Pikrat und 2,4-DNP.Item Open Access (+)-4-Carboxymethyl-2,4-dimethylbut-2-en-4-olide as dead-end metabolite of 2,4-dimethylphenoxyacetic acid or 2,4-dimethylphenol by alcaligenes eutrophus JMP 134(1990) Pieper, Dietmar H.; Engesser, Karl-Heinrich; Knackmuss, Hans-Joachim2,4-Dimethylphenoxyacetic acid and 2,4-dimethylphenol are not growth substrates for Alcaligenes eutrophus JMP 134 although being cooxidized by 2,4-dichlorophenoxyacetate grown cells. None of the relevant catabolic pathways were induced by the dimethylphenoxyacetate, 3,5-Dimethylcatechol is not subject to metacleavage. The alternative ortho-eleavage is also unproductive and gives rise to (+)-4-carboxymethyl-2,4-dimethylbut-2-en-4-olide as a dead-end metabolite. High yields of this metabolite were obtained with the mutant Alcaligenes eutrophys JMP 134-1 which constitutively expresses the genes of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid metabolism.Item Open Access Mikrobielle Biosynthese von (3S,4R)-4-Amino-3-hydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure mit rekombinanten Escherichia coli-Zellen : molekulargenetische und biochemische Untersuchungen(2006) Kozak, Stefan; Sprenger, Georg (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit war die mikrobielle Biosynthese des Aminocyclitols (3S,4R)-4-Amino-3-hydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (3,4-CHA) aus dem nachwachsenden Rohstoff Glu-kose; sie sollte ausgehend von Chorisminsäure über das Intermediat 4-Amino-4-desoxychoris-minsäure (ADC) ablaufen. Chorisminsäure ist der zentrale Verzweigungspunkt bei der Bio-synthese von aromatischen Verbindungen in Escherichia coli, ADC tritt in E. coli als Inter-mediat bei der Biosynthese von p-Aminobenzoesäure auf. Durch eine für E. coli nicht physiologische Etherspaltung sollte dann ADC zum Zielprodukt 3,4-CHA und Pyruvat umge-setzt werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein Enzym beschrieben worden war, das diese Reaktion katalysiert, war zunächst nicht bekannt, ob und mit welchem Enzym diese Reaktion durchführbar sein würde. Zunächst wurde das vermutete Gen einer ADC-Synthase, pabAB, aus Corynebacterium gluta-micum in den Expressionsvektor pJF119EH kloniert. Der E. coli-Stamm KB532, ein Stamm mit einem erhöhten Stofffluss zu Chorisminsäure, wurde anschließend mit dem Plasmid transformiert und fermentiert. Im Fermentationsüberstand wurden 7 g/l ADC und 15,4 g/l Chorisminsäure nachgewiesen. Somit konnte ein ADC-produzierender E. coli-Stamm etab-liert und gezeigt werden, dass das Gen pabABC.gl. eine aktive ADC-Synthase kodiert. Um ein geeignetes Konstrukt für die Umsetzung von ADC zu 3,4-CHA zu erhalten, wurde das Gen His10-phzD, das ein Fusionsprotein der Isochorismatase PhzD aus Pseudomonas aeruginosa mit einem aminoterminalen Histidinschwanz kodiert, zusammen mit pabABC.gl. in den Expressionsvektor pJF119EH kloniert. Dieses Plasmid wurde anschließend in den E. coli-Stamm KB532 transformiert. Bei einer Fermentation des erzeugten Stammes konnte im Kul-turüberstand eine maximale Produktkonzentration von 2,8 g/l 3,4-CHA erreicht werden; die Cyclohexadiendiolcarbonsäure (3S,4R)-3,4-Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (3,4-CHD) trat hierbei als Nebenprodukt auf. Das Verhältnis von gebildetem 3,4-CHA zu 3,4-CHD schwankte je nach Fermentationsbedingungen und -dauer zwischen 1:1 und 1:3. Die erreichten Produktausbeuten zeigen, dass PhzD sowohl ADC als auch Chorisminsäure als Substrate akzeptiert und diese zu 3,4-CHA und Pyruvat bzw. 3,4-CHD und Pyruvat umsetzt. Dies war auch während der Durchführung dieser Arbeit berichtet worden (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693), jedoch war die bei der Fermentation erhaltene 3,4-CHA-Produktausbeute größer, als die veröffentlichten Ergebnisse erwarten ließen. Die Isochorismatase PhzD aus Pseudomonas aeruginosa und die Isochorismatase EntB aus Escherichia coli wurden biochemisch charakterisiert. Das phzD-Gen wurde kloniert und als Fusionsprotein mit einem aminoterminalen 10-fachen Histidinschwanz überexprimiert; entB wurde ebenfalls kloniert und mit einem 6-fachen carboxyterminalen Histidinschwanz über-exprimiert. Ausgehend vom Rohextrakt eines rekombinanten E. coli-Stamms wurden die bei-den Enzyme in einem Schritt mittels Ni2+-Affinitätschromatographie bis zur apparenten Ho-mogenität aufgereinigt. Die Ausbeute betrug hierbei je Liter Expressionskultur 20 mg EntB-Fusionsprotein bzw. 25 mg PhzD-Fusionsprotein. Von beiden aufgereinigten Enzymen wur-den die kinetischen Parameter für die Substrate ADC und Chorisminsäure mit einem ge-koppelten Enzymtest bestimmt. Bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 37 °C wurden für PhzD die folgenden Werte für kcat und KM ermittelt. Für das Substrat ADC beträgt der KM-Wert 1,5 ± 0,3 mM und kcat ist 4,1 ± 0,12 s-1; bei dem Substrat Chorisminsäure beträgt der KM-Wert 1,2 ± 0,15 mM und kcat 39 ± 0,8 s-1. Für das Enzym EntB wurden unter den gleichen Bedingungen für das Substrat ADC ein KM-Wert von 1,4 ± 0,3 mM und ein kcat-Wert von 2 ± 0,05 s-1 bestimmt. Für das Substrat Chorisminsäure betrug der KM-Wert 1,1 ± 0,15 mM und kcat 56 ± 3 s-1. Die kinetischen Parameter zeigen, dass mit beiden Enzymen die Um-setzung von ADC zu 3,4-CHA und Pyruvat möglich ist. PhzD ist jedoch hierfür besser geeig-net, während sich EntB besser für die Umsetzung von Chorisminsäure zu 3,4-CHD und Pyruvat eignet. Die ermittelten kinetischen Parameter für PhzD unterscheiden sich von den bereits veröffentlichten Werten (Parsons, J. et al. (2003) Biochemistry 42: 5684-5693). Wäh-rend die Werte für KM in der gleichen Größenordnung liegen, sind die bestimmten Werte für kcat für die beiden Substrate Chorisminsäure und ADC deutlich größer als beschrieben.Item Open Access Der Abbau von Modellstrukturen der Kohle: Stoffwechselweg des Dibenzofuran- und Fluorenabbaus(1991) Engesser, Karl-Heinrich; Strubel, Volker; Trenz, Stefan Peter; Rothe, Bernd; Schmid, Andreas; Knackmuss, Hans-JoachimSeveral microorganisms have been isolated degrading structural elements of coal like dibenzofuran. fluorene and biphenyl. Extensive investigation of the degradation pathways revealed a common mechanism of initial attack. Although catalyzed by different enzymes, all three substrates are converted to 3-phenyl-substituted catechols, which, after meta-cleavage are transformed to simple aromatic structures like salicylate, phthalate and benzoate. This ring cleaving enzymes have been cloned and are further analyzed after subcloning. Two different initial dioxygenases seem to be present in some strains cataIyzing ether cleavage of dibenzofuran and oxygenation of biphenyl respectively. Attempts are presently made to clone the first enzyme in order to produce higher yields of its optically active products. Some of these compounds have been characterized and may be of commercial value as fine chemicals.