04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Lokalisation, Speicherung und Synthese von Polyphosphat in Agrobacterium tumefaciens C58(2021) Hellenbroich, Celina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr. rer. nat.)Polyphosphat (PolyP) besitzt eine ubiquitäre Verbreitung und erfüllt, je nach Organismus, unterschiedliche und extrem vielfältige Aufgaben. In Prokaryonten liegt PolyP in sogenannten Granula vor, während in einzelligen Eukaryonten, eine Membran das PolyP von dem Cytoplasma abtrennt. Vorangegangene Arbeiten weisen darauf hin, dass sogenannte Acidocalcisomen, eben jene membranumschlossene PolyP-Speicher aus Eukaryonten, auch in dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens vorhanden sein könnten. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass sich in A. tumefaciens, wie in Bakterien übliche, PolyP-Granula befinden, die nicht von einer Membran umschlossen sind. Im weiteren Verlauf wurde die Synthese von PolyP sowie die Lokalisation der Polyphosphatkinasen (PPKs) und anderer aus der Literatur bekannter, PolyP-assoziierter Proteine untersucht. Die PPK1At stellte sich hierbei als PolyP-Syntheseenzym heraus. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der PPKs in vitro, bei der für die PPK2At, neben der Bildung von NDP und NTP, eine oligophosphorylierende Funktion bis hin zu nonaphosphorylierten Nukleosiden entdeckt wurde. Außerdem stellte sich heraus, dass das PolyP-Granulum während des Zellzyklus wanderte und vielleicht durch die PPK1At mit der DNA assoziiert sein könnte. Aufgrund dieser Erkenntnisse konnte ein Modell des PolyP-Granulums und den in dieser Arbeit identifizierten, assoziierten Proteinen erstellt werden. Eine Deletion der ppk1 hatte zudem Auswirkungen auf die Zellmorphologie, die Infektionsrate von Pflanzenzellen und die Generationszeit von A. tumefaciens.Item Open Access Biotechnological production of aromatic amines and aromatic alcohols by recombinant Escherichia coli strains(2019) Mohammadi Nargesi, Behrouz; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Aromatic amine (AA) are an important group of industrial chemicals which are widely used for technical and pharmaceutical applications and described as the building block of drugs (Bedair et al. 2006; Jobdevairakkam and Velladurai 2009; Sacco and Bientinesi 2016), antibiotics, plastics and aromatic polymers (Arora 2015; Masuo et al. 2016; Tsuge et al. 2016; Kawasaki et al. 2018). In addition, aromatic alcohols, as other valuable compounds, are widely used in manufacturers of perfumes, cosmetics, and foods, and pharmaceutical industry (Etschmann et al. 2002; Miró-Casas et al. 2003; Bai et al. 2014). Most of the AAs and aromatic alcohols are chemically synthesized from petroleum sources and considered as “unnatural”, which are inappropriate to make cosmetic, drugs or food ingredient, thereby natural microbial biosynthesis of these valuable compounds in E.coli would be an alternative approach. In the first part of this study, a de-novo biosynthesis pathway was established for high titer production of three aromatic amines, para-amino-L-phenylalanine (L-PAPA), para-amino-phenylethanol (PAPE) and para-amino-phenylacetic acid (4-APA) from glucose/glycerol via genetic modification of the shikimate pathway in recombinant E. coli (Mohammadi et al. 2018 and 2019). To generate a platform strain for L-PAPA production from shikimate pathway, the genes pabAB from Corynebacterium glutamicum (Kozak 2006), papB and papC from Streptomyces venezuelae (Blanc et al. 1997; He et al. 2001; Mehl et al. 2003) were heterologously overexpressed from plasmid in E. coli FUS4.7R (Gottlieb et al. 2014). Then, the metabolic flux was directed to PAPE and 4-APA production via overexpression of aro10 from Saccharomyces cerevisiae (Kneen et al. 2011; Vuralhan et al. 2003 and 2005) and both aro10 and feaB in E. coli FUS4BCR, respectively. The engineered E. coli strains were cultured in the shake-flasks with fed batch condition and investigated for L-PAPA, PAPE and 4-APA production by HPLC and LC-MS. In the simple shake flask experiments, the plasmid based strain produced L-PAPA as high as 0.534 ± 0.024 g l-1 from 5 ± 0.24 g l-1 glycerol. Also, introduction of aro10 and yahK in L-PAPA producing strain resulted in 0.526 ± 0.025 g l-1 PAPE. Furthermore, by introducing feaB into the PAPE- producing strain, 4-APA was obtained with a titer of 0.458 ± 0.014 g l-1. Last but not least, by further strain improvement and optimizing growth condition via glucose/glycerol feed strategy, an increasing titer of L-PAPA, PAPE and 4-APA approximately 5.5 ± 0.4 g l-1, 2.5 ± 0.15 g l-1 and 3.4 ± 0.3 g l-1 were obtained, respectively. In subsequent fed-batch cultivation with a final volume of 12.2 l and the carbon sources glycerol, a final L-PAPA-titer of 16.8 g l-1 was obtained. This equals a yield of 0.13 L-PAPA / glycerol (g g-1) and a space-time-yield of 0.22 g l-1 h-1 L-PAPA formation over the whole process. Furthermore, a de-novo biosynthesis pathway for the production of 2-Phenylethanol (2-PE)/tyrosol from glucose with genetically engineered E. coli strains without additional L-phenylalanine/ L-tyrosine as supplement was demonstrated. Starting from chorismate, which is the direct precursor of phenylpyruvate (PP)/ 4-Hydroxyphenylpyruvate (4-HPP), an artificial Ehrlich biosynthesis pathway was created (Etschmann et al. 2002) toward 2-PE or tyrosol. To generate a platform strain for production of 2-PE and tyrosol from shikimate pathway, the genes pheA or tyrA encoding proteins chorismate mutase/prephenate dehydratase or prephenate dehydrogenase (feedback resistance variant, Rüffer et al. 2004; Gottlieb et al. 2014), respectively, were cloned and subsequently overexpressed from plasmid in E. coli. In the next step, the metabolic flux was directed to 2-PE and tyrosol production via overexpression of aro10 encoding phenylpyruvate decarboxylase from S. cerevisiae. Furthermore, in order to enhance the flux toward downstream 2-PE/tyrosol pathway, the relevant genes of three rate limiting steps including aroF, aroB and aroL were subcloned and overexpressed from plasmid. Upon simple batch cultivation, these strains separately yielded 369 ± 25 mg l-1 2-PE and 437 ± 33 mg l-1 tyrosol from 4.5 ± 0.21 g l-1 glucose. Final titer in the shake flask was further improved through glucose fed-batch fermentation to 1.75 ± 0.12 g l-1 2-PE and 1.68 ± 0.19 g l-1 tyrosol. The subsequent significant enhancement of 2-PE/tyrosol production occurred through employing in situ product removal (ISPR) techniques including two-phase extraction by different organic compounds (Etschmann et al. 2002; Rüffer et al. 2004; Schügerl and Hubbuch 2005; Hu and Xu 2011; Chreptowicz et al. 2018). In subsequent glucose-limited fed-batch cultivation with a benchtop bioreactor system (0.75 l), a final 2-PE and tyrosol-titer of 3.1 g l-1 and 3.6 g l-1 reached with a yield and a space-time-yield of 0.07 g g-1 and 0.03 g l-1 h-1 for 2-PE and 0.08 g g-1 and 0.04 g l-1 h-1 for tyrosol, respectively. These works have successfully demonstrated the possibility of synthesizing of several invaluable fine chemicals in whole-cell system using plasmid based-E.coli strains. In addition, the titter and yield previously reported in the biosynthesis of aromatic amines (L-PAPA, PAPE or 4-APA) or even aromatic alcohols (2-PE or tyrosol) have been significantly improved in this study.Item Open Access Biotechnologische Darstellung und strukturelle Charakterisierung fucosylierter Oligosaccharide(2016) Baumgärtner, Florian; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Die in Muttermilch mit bis zu 15 g l-1 enthaltenen humanen Milcholigosaccharide (HMOs) stellen eine bedeutende Gruppe bioaktiver Naturstoffe dar und zeigten in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten zahlreiche positive Effekte für die Entwicklung von Säuglingen. Mit über 200 beschriebenen und über 100 strukturell charakterisierten Oligosacchariden weisen HMOs dabei eine große Strukturvielfalt auf. Untersuchungen der physiologischen Effekte von HMOs wurden in der Vergangenheit neben wenigen isolierten oder synthetisierten Reinstoffen häufig mit HMO-Gemischen durchgeführt, welche aus humaner Milch isoliert wurden. Der Grund hierfür ist, dass chemische Synthesen wegen der benötigten Schutzgruppenchemie aufwändig sind und enzymatische Synthesen mit Leloir-Glycosyltransferasen bzw. Glycosidasen kostspielige Nukleotid-aktivierte Zucker als Substrate benötigen bzw. geringe Produktausbeuten zeigen. Durch die Kombination hoher Regio- und Stereoselektivitäten von Leloir-Glycosyltransferasen mit einer kostengünstigen Bereitstellung von Nukleotid-aktivierten Zuckern waren in der Vergangenheit Ganzzellsynthesen einiger HMOs unter Verwendung von Plasmid-basierten Expressionen rekombinanter Gene beschrieben worden. Um die Synthese weiterer HMOs mittels Ganzzellsynthesen zu ermöglichen und dabei auf die Verwendung von Selektions-Systemen für Plasmid-tragende Zellen verzichten zu können, wurden in dieser Arbeit Plasmid-freie Stämme zur Synthese verschiedener HMOs konstruiert und die damit synthetisierten Oligosaccharide isoliert sowie analysiert. Die Stammkonstruktion erfolgte dabei durch chromosomale Integration von Expressionskassetten in Zuckerdegradations-Loci mittels homologer Rekombination und Selektion auf die Ortsspezifität der Integration mittels pH-Indikator Agarplatten. Unter Verwendung verschiedener Glycosyltransferase-Gene aus Helicobacter pylori, Escherichia coli und Neisseria meningitidis in Escherichia coli-Zellen, welche Nukleotid-aktivierte Zucker bereitstellen und Lactose aufnehmen, konnten so unter anderem die HMOs 2‘-Fucosyllactose (2‘-FL), 3-Fucosyllactose (3-FL), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-fucopentaose I (LNFP I) und Lacto-N-difucohexaose II (LNDFH II) synthetisiert, isoliert und charakterisiert werden. Basierend auf den bereits vor dieser Arbeit am Institut für Mikrobiologie der Universität Stuttgart konstruierten E. coli Stämmen JM109 gwBC-F1 und JM109 gwBC F2-cat konnte eine Erhöhung der Produktivität von 2‘-FL durch die Erhöhung der chromosomal integrierten Kopien des Fucosyltransferase-Gens futC aufgezeigt werden. Außerdem konnte durch die zusätzliche Nutzung des Salvage Pathway für die Synthese von GDP-L-Fucose die Produktbildung weiter erhöht werden. Dabei wurden in Schüttelkolben-Kulturen mit Plasmid-freien Stämmen 2‘-FL-Titer von 1,06 ± 0,21 g l-1 bzw. 2,00 ± 0,04 g l-1 ohne bzw. mit Nutzung des Salvage Pathway erreicht. In einer darauffolgenden, Antibiotika-freien Zulaufkultivierung mit einem Endvolumen von 13,5 l und den Kohlenstoffquellen Glycerin und Lactose wurde ein 2‘-FL-Titer von 20,28 ± 0,83 g l-1 und somit etwa 270 g 2‘ FL mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,57 g l 1 h-1 produziert. In einem weiteren Teil dieser Arbeit konnte durch die Konstruktion des Stammes E. coli LJ-AYO-cat mit integrierten Genen einer Lactose-Permease, β1,3-N-Acetylglucosaminyl-transferase und β1,3-Galactosyltransferse erstmals die Synthese des HMO LNT in rekombinanten Mikroorganismen beschrieben werden. Dabei wurde unter Verwendung von Galactose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu Glycerin bzw. Glucose eine höhere intrazelluläre Konzentration des Donor-Substrats UDP-Galactose bestimmt, in Schüttelkolben 0,81 ± 0,01 g l-1 LNT synthetisiert und in einer Galactose-limitierten Zulaufkultivierung ein LNT-Titer von 12,72 ± 0,21 g l-1 erreicht. Bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,37 g l-1 h-1 wurden so 173 g des Tetrasaccharids LNT produziert. Durch die Ausstattung dieses LNT-synthetisierenden Stammes mit den Genen einer α1,2 bzw. α1,4-Fucosyltransferase und dem Salvage Pathway zur Synthese von GDP-L-Fucose wurden anschließend erstmalig rekombinante Ganzzellsynthesen fucosylierter Derivate von LNT beschrieben und dabei in Schüttelkolben-Kulturen 0,272 ± 0,006 g l-1 LNFP I bzw. 0,547 ± 0,004 g l-1 LNDFH II gebildet. Die Strukturen der gebildeten HMOs konnten nach der Isolierung jeweils mittles Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Somit konnten in dieser Arbeit die Ganzzellsynthesen verschiedener HMOs mit Plasmid-freien Stämmen dargestellt, die Titer und Raum-Zeit-Ausbeuten in der Synthese von 2‘ FL erhöht und die Auswahl der mittels Ganzzellsynthesen herstellbaren HMOs um Typ I-HMO-Strukturen erweitert werden.Item Open Access Mikrobielle Biodegradation von Poly(cis-1,4-isopren) : Charakterisierung bakterieller Rubber Oxygenasen(2020) Röther, Wolf; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit untersucht den mikrobiellen Kautschukabbau. Die Rubber Oxygenase A (RoxA) wird von Gram negativen Bakterien sekretiert, wohingegen Gram positive Bakterien das Latex Clearing Protein (LCP) nutzen. Durch Vorarbeiten der AG Jendrossek war es möglich, lcpK30 aus Streptomyces sp. K30 rekombinant in E. coli zu exprimieren und das Genprodukt mittels Strep tag per Affinitätschromatografie aufzureinigen. In Zusammenarbeit mit IBA Lifesciences wurden verschiedene Strep Tactin Säulen eingesetzt und verglichen, die gewonnenen Erkenntnisse ermöglichten eine effizientere Aufreinigung von Lcp. Um spezifische Enzymaktivitäten zu vergleichen, wurde ein Aktivitätstest beschrieben, bei dem der Sauerstoffverbrauch während der Enzymreaktion bestimmt wird. Die generierten Oligo isoprenoid Spaltprodukte wurden per HPLC analysiert. Beide Methoden wurden in einem Methodenprotokoll beschrieben. In Zusammenarbeit mit Sirimaporn Watcharakul (Prince of Songkla University, Thailand) wurde ein neues kautschukabbauendes Bakterium aus dem Abwasser einer Kautschukfabrik in Thailand isoliert und als Rhodococcus rhodochrous RPK1 beschrieben. Das für die Latexspaltung verantwortliche Gen wurde als homologes LCP identifiziert und lcpRr konnte erfolgreich rekombinant in E. coli exprimiert werden. Die Aufreinigung des Genproduktes erfolgte per Affinitätschromatografie mittels Strep tag und ermöglichte die biochemische Charakterisierung von LcpRr. Durch eine bioinformatische Analyse wurden in einem Multisequenzalignment hochkonservierte Aminosäurereste in Lcps identifiziert. Drei dieser Reste sind in einer Domäne unbekannter Funktion (DUF2236) lokalisiert. Mittels Quikchange PCR wurden in lcpK30 die entsprechenden Codons jeweils einzeln gegen Alanin Codons ausgetauscht und die generierten Muteine aufgereinigt, um die mögliche Funktion der jeweiligen Reste in Lcp K30 zu untersuchen. R164A und T168A enthielten jeweils eine Hämgruppe, jedoch zeigten sie eine signifikant reduzierte Aktivität bei der oxidativen Spaltung von Polyisopren. Es konnte gezeigt werden, dass H198 einen axialen Liganden des Häm Eisen Ions darstellt. Die Reste R195 und R202 sind für die Struktur von LcpK30 essentiell, worauf anhand der Instabilität der entsprechenden Alanin Muteine geschlossen wurde. Diese Ergebnisse wurden nach der erfolgreichen Aufklärung der Struktur von LcpK30 durch Röntgenkristallografie bestätigt, welche in Kooperation mit Lorena Ilcu (AG Einsle, Albert Ludwigs Universität Freiburg) durchgeführt wurde. Das Enzym konnte als 3/3 Globin identifiziert werden. Der Globin Kern enthält eine b typ Hämgruppe und zeigt eine Ähnlichkeit zur Struktur von Myoglobin, weist jedoch eine zusätzliche L Helix auf und wird von weiteren C und N terminalen Helices umschlossen. Durch weitere Experimente gelang es, zwei mögliche Reaktionsmechanismen der oxidativen Polyisopren Spaltungsreaktion zu postulieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass das Häm Eisen Ion von LcpK30 sowohl pentakoordiniert, als auch hexakoordiniert vorliegen kann, was durch eine Verdrängung des zweiten axialen Häm Liganden K167 durch Imidazol in einer weiteren aufgeklärten Kristallstruktur gezeigt wurde. Die enzymatische Synthese von Oligo isoprenoiden im 100 mg Maßstab wurde durch eine Vergrößerung des Reaktionsansatzes auf 1 Liter Latexmilch erreicht und ermöglichte es, per FPLC eine Auftrennung der Mischung zu erzielen und reine Oligo isoprenoide bereitzustellen. Im mittlerweile komplett sequenzierten Genom von Xanthomonas sp.35Y wurde ein zu roxA homologes Gen identifiziert. Es gelang, dieses rekombinant zu exprimieren und das entsprechende Protein chromatografisch aufzureinigen. Dessen biochemische Charakterisierung zeigte Ähnlichkeiten zu RoxA wie eine vergleichbare Molekülmasse, sowie zwei Häm Bindemotive. Bei der Inkubation mit Latexmilch wurde der Verbrauch von Sauerstoff beobachtet, jedoch wurde per HPLC nicht das C15 Oligo isoprenoid 12 oxo 4,8 dimethyl trideca 4,8 dien 1 al (ODTD) als Hauptprodukt identifiziert, sondern die bereits bei Lcp beobachtete Mischung höherer Oligo isoprenoide. Daher wurde das Enzym RoxB genannt. Des Weiteren wurde ein synergistischer Effekt der Enzymaktivität von RoxB auf RoxA beschrieben. Dieser Effekt wurde auch für Rhizobacter gummiphilus bestätigt, indem beide Rubber Oxygenasen dieses Stammes aufgereinigt und charakterisiert wurden. Wachstumsversuche mit verschiedenen Bakterienstämmen wurden durchgeführt und es gelang erstmals, eine Wachstumskurve von Xanthomonas sp.35Y beim Wachstum in Flüssigkultur mit Latex als alleiniger Kohlenstoffquelle zu bestimmen. Die so gewonnenen Zellen wurden zur Proteomanalyse eingesetzt und zahlreiche Proteine des Metabolismus konnten nachgewiesen werden.Item Open Access Enzymatische Hydrolyse sterisch anspruchsvoller Nitrile und Darstellung von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren durch bienzymatische Ganzzellkatalyse in Gegenwart ionischer Flüssigkeiten(2023) Fischer, Stefanie; Stolz, Andreas (Prof. Dr.)Item Open Access Identifizierung zweier Gencluster (atuABCDEFGH, liuRABCDE) in Pseudomonas aeruginosa PAO1 und deren funktionelle Analyse im Metabolismus methylverzweigter Verbindungen(2006) Höschle, Birgit; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr.)Azyklische Terpene wie Citronellol und Geraniol sind in der Natur weit verbreitete Geruchsstoffe, die aufgrund ihrer β-methylverzweigten Struktur von Mikroorganismen nur schwer metabolisiert werden können. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau azyklischer Terpene in Pseudomonas aeruginosa PAO1 untersucht. 1. Durch Insertionsmutagenesen wurden zwei Gencluster identifiziert, die für die meisten der in früheren biochemischen Beiträgen postulierten Abbauschritte codieren. Das erste Gencluster besteht aus acht Genen und einem potentiellen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2885 bis PA2993 der P. aeruginosa PAO1 Datenbank. Das zweite Gencluster (gny-Cluster), welches durch Diaz-Perez und Mitarbeiter identifiziert wurde [DIAZ-PEREZ et al. (2004), Appl Environ Microbiol 70: 5102] besteht aus fünf Genen und einem vermeintlichen Regulatorgen und entspricht den Genprodukten der ORF PA2016 bis PA2011. 2. Insertionen im ersten Gencluster (PA2890 und PA2891) führten zu einem Verlust des Wachstums auf azyklischen Terpenen, die Fähigkeit zum Wachstum auf Leucin und Isovaleriansäure war nicht beeinträchtigt. Insertionen im zweiten Gencluster (PA2012 und PA2013) führten hingegen zum Verlust des Wachstums sowohl auf azyklischen Terpenen (Citronellol, Geraniol) als auch auf Leucin und Isovaleriansäure. Das erste Gencluster wurde als atu- (acyclic terpene utilization) Gencluster bezeichnet, das gny-Cluster wurde in das liu- (leucine/isovalerate utilization) Gencluster umbenannt. 3. Der aus biochemischen Untersuchungen postulierte Abbauweg von Citronellol enthält zwei charakteristische Carboxylierungsschritte (Geranyl-CoA-Carboxylase [GCase] und Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase [MCase]). Diese wandeln die β-Methylverzweigungen in Acetatseitengruppen um, welche in anschließenden enzymatischen Reaktionen abgespalten werden. Beide Carboxylasen wurden durch Avidin-Affinitätschromatographie aus Zellextrakten gereinigt und durch Trypsin-Fingerprint-Massenspektrometrie als Genprodukte von PA2888/PA2891 (atuD/atuF; GCase) bzw. als Genprodukte von PA2014/PA2012 (liuB/liuD; MCase) eindeutig identifiziert. Durch Western-Blot Analysen und Aktivitätsbestimmungen der GCase und MCase wurde bestätigt, dass die GCase (AtuF) nur beim Wachstum auf Citronellol, die MCase (LiuD) sowohl beim Wachstum auf Citronellol als auch beim Wachstum auf Leucin bzw. Isovaleriansäure induziert wurde. 4. Für die übrigen Genprodukte des atu- und liu-Genclusters konnten die möglichen biochemischen Funktionen durch Datenbankvergleiche vorhergesagt werden. 5. Vorausgesagte Genprodukte mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des liu-Clusters konnten in anderen Pseudomonaden (P. putida KT2440, P. fluorescens Pf-5, P. syringae tomato DC3000) nachgewiesen werden. Vorausgesagte Proteine mit hohen Ähnlichkeiten zu den Genprodukten des atu-Clusters konnten nur in P. fluorescens Pf-5 festgestellt werden, der als einziger dieser Pseudomonaden in der Lage ist, Citronellol als Kohlenstoffquelle zu verwerten. 6. Das atu-Cluster aus P. aeruginosa PAO1 konnte in die Pseudomonaden P. putida, P. fluorescens GK13 und P. oleovorans übertragen werden. Keiner dieser rekombinanten Stämme war anschließend in der Lage, Citronellol und Geraniol als Kohlenstoffquelle verwerten, so dass offenbar noch weitere, bislang unbekannte Gene für einen funktionellen Abbauweg notwendig sind. 7. Die Untersuchungen von weiteren Transposoninsertionsmutanten und Hemmversuche mit Wolframat ergaben, dass die Oxidation von Geraniol über molybdänabhängige Schritte verläuft, und somit unterschiedlich zur Oxidation von Citronellol ist. Weiterhin zeigte sich, dass das moeA2-Gen (ORF PA3028), welches an der Molybdäncofaktor-Biosynthese beteiligt ist, für die Verwertung von Geraniol essentiell ist.Item Open Access Identifizierung neuer Proteine des PHB-Granulumkomplexes und Charakterisierung von PHB Depolymerasen in Ralstonia eutropha H16(2016) Sommer, Anna Karolina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr.)Item Open Access Introduction of novel artificial pathways in Escherichia coli with fructose 6-phosphate aldolase (FSA)(2024) Guitart Font, Emma; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Fructose 6-phosphate aldolase (FSA) enzymes are known to catalyse aldol and retroaldol reactions. These reactions have been shown in vitro by Schürmann and Sprenger (2001), Schürmann et al. (2002), Garrabou et al. (2009), Castillo et al. (2010), Sánchez-Moreno et al. (2012a and 2012b), among other groups. However, it was unclear whether these reactions would be possible in vivo. Since the discovery of FSA, encoded by the genes fsaA and fsaB in the Escherichia coli chromosome in 2001 (Schürmann and Sprenger, 2001), its true physiological function has not been reported yet (Samland and Sprenger, 2014). Due to the weak expression of the native promoters of fsaA and fsaB, the only enzymatic data reported so far are from recombinant FSA. To evaluate whether the cleavage of fructose 6-phosphate (F6P) in glycolysis, and the formation of arabinose 5-phosphate (A5P) in the synthesis of 2-keto-3-deoxymanno-octulosonic acid (KDO) could also be catalysed in vivo by FSA, E. coli mutant strains with numerous mutations in metabolic pathways were constructed. These mutant strains had blockades in central carbon metabolism or anabolism. Thus, these mutations impacted pleiotropic genes and, therefore, growth. Afterwards, it was examined if the activity of recombinant FSA in these mutant strains could restore deficiencies in growth. With the reactions catalysed by FSA, the blocked pathways were not restored, but new artificial pathways emerged. Through the F6P bypass a new route for the production of dihydroxyacetone (DHA) and glycerol was opened. Furthermore, a new approach for the provision of A5P was established.