04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Metabolismus nicht-physiologischer Substrate in Mikroorganismen(2016) Reznicek, Ondrej; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Biotechnologische Herstellung von Octan- und 8-Hydroxyoctansäure mit Escherichia coli(2016) Kirtz, Marko; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)In den letzten 20 Jahren rückt die Entwicklung biotechnologischer Prozesse zur Produktion von Diesel- und Benzinersatzstoffen immer mehr in den Fokus von Forschung und öffentlichem Interesse. Durch die Verknappung der Erdölressourcen[1], die negativen Auswirkungen der extensiven Nutzung dieser Ressourcen auf die Umwelt und nicht zuletzt das stetig wachsende Umweltbewusstsein der Bevölkerung in Industrieländern, wurden Prozesse gefordert, die auf regenerierbaren Ressourcen basieren, somit den permanent in Richtung Atmosphäre gerichteten CO2-Fluss eingrenzen und zudem die Kostenexplosion für Kraftstoffe eindämmen. Jedoch ist nicht nur der weltweite Transportsektor von Erdöl und seinen weiterverarbeiteten Produkten abhängig, auch die produzierende chemische Industrie bezieht einen Großteil ihrer Grundstoffe aus dem „schwarzen Gold“[2,3,4,5]. Hier gilt es, effektive alternative Prozesse zu entwickeln, die zum Großziel einer „grünen Chemie“ beitragen und von der Abhängigkeit von Erdöl losgelöst sind. Diese Arbeit hatte das Ziel durch die Realisierung eines mikrobiellen Produktionsprozesses von mittelkettigen Fett- und ω-Hydroxyfettsäuren einen Beitrag zum Ziel der sog. „grünen Chemie“ zu leisten. Die wirtschaftliche und damit einhergehend umweltschutztechnische Relevanz von Fettsäuren und ihren terminal hydroxylierten Derivaten spiegelt sich in der großen Vielfalt an Produkten, deren Grundbausteine sie bilden, wider. Zum Einsatz kam hier das Bakterium Escherichia coli, für welches bereits in vergangenen Studien Strategien entwickelt worden waren, um beispielsweise (Hemi-)Cellulosen für den Aufbau von eigener Biomasse verwerten zu können[6]. Daher ist es für einen Ansatz, der auf regenerierbaren Ressourcen beruhen soll, bestens geeignet. Um mit diesem Bakterium in einem Produktionsprozess Fettsäuren zu generieren, musste seine native Fettsäurebiosynthese zu einer Überproduktion der gewünschten Fettsäure angeregt werden. Dazu wurde die pflanzliche Thioesterase FatB2 aus Cuphea hookeriana[7] in einer β-oxidationsdefizienten Zelle überexprimiert, um sowohl die Fettsäuresynthese zu deregulieren als auch gleichzeitig die Länge des Produktes zu bestimmen. Nach einer N-terminalen Fusion des Enzyms mit dem Thioredoxin-1-Anhang trxA und einigen Optimierungen des Produktionsprozesses, konnten mit diesem System in 24 h etwa 330 mg/L der für die Zellen toxischen Fettsäure Octansäure in einem Bioreaktor-fed batch-Verfahren hergestellt werden. Um aus dieser Fettsäure ihr ω-hydroxyliertes Derivat zu formen, wurde in den Produktionsstamm zusätzlich ein Monooxygenase-Fusionsprotein eingebracht, das bereits aus früheren Arbeiten des ITBs hervorging[8,9]. Das Fusionsprotein von CYP153A aus Marinobacter aquaeolei mit der Reduktasedomäne CPR von CYP102A1 aus Bacillus megaterium ist in der Lage sich selbst mit Reduktionsäquivalenten zu versorgen ohne dabei auf die Hilfe einer zusätzlichen Reduktase angewiesen zu sein. Die in dieser Arbeit verwendete Mutante G307A ist zudem gegenüber Octansäure um das 20-fache aktiver als es die Wildtypform ist[9]. Diese Enzymmutante wurde in vier unterschiedlichen Ansätzen mit dem octansäureproduzierenden Bakterienstamm kombiniert. So konnte letztlich in einem Einzellsystem mit paralleler Expression der Thioesterase sowie der Monooxygenase in 20 h ein 8-Hydroxyoctansäure-Titer von etwa 230 µM erreicht werden, was umgerechnet 40 mg/L entspricht. Nachdem der erfolgreiche konzeptionelle Beweis für dieses Produktionssystem erbracht war, sollte ein ungerichtetes Mutageneseverfahren angewendet werden, um die Möglichkeit das Endprodukt nach Wunsch in seiner Länge variieren zu können, zu erhalten. Das Verfahren sollte gentechnisch veränderte Thioesterase-Varianten generieren, die verglichen zum eingesetzten Wildtypenzym eine erhöhte Aktivität gegen kürzere oder längere Fettsäuren als Octansäure aufwiesen. Für ein hierzu benötigtes high throughput screening-Verfahren sollten im Rahmen dieser Arbeit die Grundlagen erarbeitet werden. Getestet wurden dabei verschiedene Methoden des screenings sowohl auf Agarplatten und in Flüssigmedium, so beispielsweise die extrazelluläre Präsentation des Enzyms auf Hefezelloberflächen[10], als auch die Möglichkeit eines screenings mittels aufgereinigtem Enzym.Item Open Access Studien zur Optimierung der Katalyse mittels der Monooxygenase CYP153AM.aq(2017) Hoffmann, Sara Maria; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Fähigkeit von P450 Enzymen schwierige Oxidationsreaktionen mit hoher Spezifität und Selektivität zu katalysieren, macht diese Enzyme attraktiv für den Einsatz für viele biotechnologische Anwendungen. Durch die Herausforderung des Multienzymkomplexsystems bestehend aus Hämdomäne, Ferredoxin und Reduktase, als auch der meist niedrigen Aktivitäten und Stabilitäten sind noch wenige Applikationen bekannt. Diese Komplexität einer P450 Fusionsenzym katalysierten Reaktion wurde im Detail in dieser Arbeit studiert um Potentiale zu identifizieren, die zur Steigerung der Aktivität, Stabilität und Produktivität führen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden dabei Ansatzpunkte zur Optimierung auf der Enzymebene untersucht. Bioinformatische Verfahren wurden für die Identifizierung von Aminosäurepositionen in der Häm- als auch der Reduktasedomäne genutzt, welche mittels Mutagenese modifiziert wurden und die resultierenden Varianten sowohl in vitro als auch in vivo im Labormaßstab getestet wurden. Zur genaueren Beschreibung des terminal hydroxylierenden P450 Enzyms CYP153AM.aq wurde in dieser Arbeit in Kooperation mit Prof. Dr. Gideon Grogan, University of York, die Kristallstruktur von CYP153AM.aq aufgeklärt. Einige charakteristische Merkmale konnten im Vergleich zu beschriebenen Struktur-elementen von P450 Enzymen identifiziert werden. Dazu zählen das Fehlen der B‘-Helix und eine verlängerte F-Helix respektive ein verkürzter FG-Loop. Weiterhin konnte anhand der Kristallstruktur dargestellt werden, dass die aktive Tasche einem ~ 20 Å langen Trichter ähnelt, dessen oberer Durchmesser ca. 12 Å und der untere 9 Å misst. Diese Geometrie wird als Voraussetzung für die Selektivität für die terminale Position des Substrats angenommen. Mutationsstudien legen dar, dass bei einer Änderung des unteren Durchmessers (L354I) die Selektivität für die ω-1 Position bevorzugt wird. Durch das Aufklären der Kristallstruktur mit dem Produkt 12-Hydroxydodecansäure konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure in der aktiven Tasche vertikal positioniert ist und mit der Carboxygruppe eine Wasserstoffbrücke zu der Aminosäureseitenkette von Glutamin 129 bildet. Eine P450 Fettsäure-hydroxylase mit vergleichbar ausgeprägten Strukturelementen wurde bisher noch nicht beschrieben. Diese charakteristischen Strukturelemente führten zu der Annahme, dass Substratkanalverläufe in CYP153AM.aq sich von den bisher beschriebenen unterscheiden. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joelle Pelletier, Université de Montréal, konnten durch molekular dynamische Simulationen gezeigt werden, dass die bisher als sekundär beschriebenen Substratkanäle in bakteriellen P450 Enzymen, die energetisch favorisierten Kanäle in CYP153AM.aq darstellen. Die Analyse von Energiebarrieren dieser Kanäle ermöglichte den Entwurf einer rationalen Mutantenbibliothek zur Steigerung der Aktivität gegenüber Fettsäuren als auch zur Erweiterung des Substratspektrums zu Alkanen. Dabei konnte dargelegt werden, dass die Verankerung der Carboxygruppe durch das Einführen einer Guanidinogruppe in Form eines Arginins für die Dodecan- als auch für die Octansäure verbessert werden konnte. Das Entfernen der funktionellen Gruppe an dieser Position durch die Substitution zu Alanin ermöglichte den Umsatz des Alkans n-Octan. Weitere Positionen, wie A231 und P135 konnten durch das Analysieren der Kristallstruktur und der Substratkanäle für eine Erhöhung der Aktivität um das 3-fache gegenüber Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen identifiziert werden. So konnte S140R / A231G bzw. S140R / P135A als die besten Variante für Hexadecansäure, A231G für Dodecansäure und A231G / G307A für Octansäure identifiziert werden. Aufgrund des Multienzymkomplexes des P450 Fusionskonstrukts wurde auf Enzym-ebene die Hämdomäne als katalysierende Domäne als auch das Zusammenspiel dieser mit der Reduktasedomäne analysiert. Im Fokus stand hierbei die genaue Untersuchung der Elektronenübertragung von NAD(P)H über die Reduktase hin zur Hämdomäne mit dem Ziel diese zu optimieren, einhergehend mit einer gesteigerten Stabilität des Enzyms und einer Steigerung der Aktivität. In Kooperation mit Dr. Łukasz Gricman konnten Interaktionsflächen auf der Oberfläche (redox partner interaction sites (RPIs)) der Hämdomänen in Klasse II P450 Enzymen identifiziert werden, die für einen effizienten Kontakt zwischen den Domänen beschrieben wurden. Der Vergleich dieser Regionen zwischen Klasse I und Klasse II P450 Enzymen deckte Unterschiede der Eigenschaften der Aminosäure-seitenketten auf. So konnten Positionen in CYP153AM.aq identifiziert werden, die durch Mutagenese zu der entsprechenden Aminosäure geändert wurden. Ziel dabei war es, die Fusion zwischen der Klasse I Hämdomäne und der Klasse II Reduktase CPR zu verbessern. Eine 1,3-fach verbesserte Kopplungseffizienz, was als Quotient der Produktbildungsrate und der NAD(P)H Oxidationsrate definiert ist, und somit ein Maß für die Elektronenübertragung darstellt, konnte durch eine einzelne Punktmutation auf der Oberfläche von CYP153AM.aq erzielt werden. Weitere Fusionskonstrukte mit den Reduktasedomänen PFOR aus CYP116B3 als auch Rhf aus CYP116B2 wurden erstellt um ein Klasse VII P450 zu erhalten, was der natürlichen Konstellation von Hämdomäne und Reduktasepartnern in CYP153AM.aq. näher kommt. Beide dieser Reduktasen tragen FMN und FeS als prosthetische Gruppen. Der Fokus dieser Studie lag dabei eine erhöhte Aktivität und Stabilität einhergehend mit verbesserter Kopplungseffizienz zu erzielen. Die initialen Aktivi-täten von CYP153AM.aq-Rhf waren deutlich niedriger als in der Fusion CYP153AM.aq-PFOR. Letzteres wurde deshalb im Detail bezüglich der Linkersequenz studiert, die die Domänen Häm und Reduktase verbindet. Durch das Anpassen der Linkerlänge konnte in dieser Arbeit ein Fusionskonstrukt generiert werden, das eine um ~2-fache erhöhte initial rate in vitro gegenüber dem Substrat Dodecansäure und durch eine Kopplungseffizienz von 94 % eine um 67 % gesteigerte Stabilität der Hämdomäne und um 17 % gesteigerte Stabilität des gesamten Fusionskonstrukts aufweist. Im zweiten Teil wurden Stellschrauben zur Verbesserung der Ganzzell-Reaktion identifiziert und adressiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Fusions-konstrukt CYP153AM.aq-PFOR gegenüber einem System mit freien coexprimierten Reduktasen vorteilhaft ist. Als besonders große Einflussgröße konnte die Menge an aktivem Enzym identifiziert werden, weshalb die Expression im Detail untersucht wurde. Die besten Resultate (4-fache Steigerung) wurden bei einer Expression unter einem strikt regulierbaren Promotor erzielt. Auch die Erschwernis des Transports insbesondere von längerkettigen Fettsäuren über die Zellmembran wurde als Angriffspunkt für die Optimierung der Ganzzellreaktion erfasst. Durch die Regulation der Expression der fad Gene konnte neben dem Transport auch der Abbau der Fettsäuren und des hydroxylierten Produkts gesteuert werden. Die in vitro Mutagenese aus dem ersten Teil dieser Arbeit konnte generell auf das optimierte Ganzzellsystem übertragen werden. So stellt das in dieser Arbeit generierte P450-Fusionskonstrukt CYP153AM.aq-PFOR L2 kloniert in pBAD33 in E.coli BW25113ΔfadD einen interessanten Biokatalysator.Item Open Access Novel route to vanillin - an enzyme-catalyzed multi-step cascade synthesis(2016) Klaus, Tobias; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The selective hydroxylation of aromatic compounds is one of the most challenging chemical reactions. As an alternative to traditional chemical catalysis, biocatalysis emerged during the past decades. Hence, in the present work, a number of biocatalysts was investigated with regard to the realization of a novel synthesis route to the valuable aromatic compound vanillin, starting from the simple low-cost aromatic substrate 3-methylanisole via the intermediate products 3-methoxybenzyl alcohol or 4-methylguaiacol and via vanillyl alcohol, as an example of consecutive enzyme-catalyzed oxidation reactions accomplished in a multi-enzymatic three-step cascade reaction. For this reason a preselected set of enzymes, namely the m-hydroxybenzoate hydroxylase MobA from Comamonas testosteroni GZ39 and the cytochrome P450 monooxygenases CYP116B3 from Rhodococcus ruber DSM 44319 and CYP102A1 from Bacillus megaterium ATCC 14581, was investigated towards the selective hydroxylation of the substrate 3-methylanisole. Beside the wild type enzymes, a variant of MobA, which was created by rational protein design, and an existing focused minimal mutant library of CYP102A1 were applied in initial biotransformation reactions, combined with an efficient cofactor recycling system. Though the wild type enzymes of CYP116B3 and CYP102A1 displayed only a basic level of activity towards 3-methylanisole, highly increased activity was detected for many of the CYP102A1 variants with a maximum of 59% total conversion for the double mutant F87V/A328L. With 3-methoxybenzyl alcohol and 4-methylguaiacol both intermediate compounds of the intended cascade synthesis were generated, though 4-methoxy-2-methylphenol was the main product in most of the reactions. However, none of the so far investigated variants accepted any of the intermediate compounds as substrate. As CYP116B3 was a good candidate for further protein engineering approaches, as a basic level of activity towards the substrate of interest was already present in the wild type enzyme, a focused mutant library of 20 single mutant variants of CYP116B3 was created based on literature, sequence and structure information in order to improve the enzymes activity and selectivity towards conversion of the substrate 3-methylanisole and in order to find variants for the conversion of 3-methoxybenzyl alcohol and/or 4-methylguaiacol. Therefore a homology model of the monooxygenase domain of CYP116B3 was generated. Though, compared to the wild type, variants with up to almost six time increased activity towards the model substrate 7-ethoxycoumarin were found, total activity towards 3-methylanisole was still much lower compared to the best CYP102A1 variants. In addition, none of the variants displayed appropriate conversion of the intermediate compounds 3-methoxybenzyl alcohol and 4-methylguaiacol. Moreover, additional mutation in the literature known amino acid position 437 of CYP102A1 variant F87V/A328L revealed no benefit towards conversion of any of the substrates, too. Molecular dynamics simulations of a CYP102A1 variant with 4-methylguaiacol as substrate revealed the bottleneck in the conversion of this compound. 4-Methylguaiacol was shown to be stabilized at the entrance of the substrate access channel by the polar amino acid residues R47 and Y51. Replacement of these residues by the hydrophobic residues leucine and phenylalanine, respectively, resulted in successful conversion of 4-methylguaiacol to vanillyl alcohol, the precursor of vanillin in the intended cascade synthesis. Though, as the yield of vanillyl alcohol synthesized from 4-methylguaiacol with CYP102A1 variants was rather low, a vanillyl alcohol oxidase from Penicillium simplicissimum and rationally designed variants thereof, described in literature, were investigated. As a result, not only vanillyl alcohol but also 4-methylguaiacol was converted in high yield to vanillin. Finally, a combination of the best 4-methylguaiacol producing variant, CYP102A1 variant A328L, with the best 4-methylguaiacol converting variant, VAO variant F454Y, in one reaction system both in vitro and in vivo yielded vanillin from 3-methylanisole with a maximal product formation of 2.0% and 1.1% vanillin, respectively. We demonstrated as a proof-of-principle the establishment of the proposed multi-enzymatic three-step cascade reaction pathway. Though further optimizations concerning increase of enzyme activity and improvement of enzyme selectivity are required, the above mentioned exemplary synthesis of vanillin illustrates the capability of biocatalysis.