04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für Zellbiologie und ImmunologieAuthor: search.filters.author.Seifert, Oliver

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    Low-level endothelial TRAIL-receptor expression obstructs the CNS-delivery of angiopep-2 functionalised TRAIL-receptor agonists for the treatment of glioblastoma
    (2021) Krishna Moorthy, Nivetha; Seifert, Oliver; Eisler, Stephan; Weirich, Sara; Kontermann, Roland E.; Rehm, Markus; Fullstone, Gavin
    Glioblastoma (GBM) is the most malignant and aggressive form of glioma and is associated with a poor survival rate. Latest generation Tumour Necrosis Factor Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL)-based therapeutics potently induce apoptosis in cancer cells, including GBM cells, by binding to death receptors. However, the blood–brain barrier (BBB) is a major obstacle for these biologics to enter the central nervous system (CNS). We therefore investigated if antibody-based fusion proteins that combine hexavalent TRAIL and angiopep-2 (ANG2) moieties can be developed, with ANG2 promoting receptor-mediated transcytosis (RMT) across the BBB. We demonstrate that these fusion proteins retain the potent apoptosis induction of hexavalent TRAIL-receptor agonists. Importantly, blood–brain barrier cells instead remained highly resistant to this fusion protein. Binding studies indicated that ANG2 is active in these constructs but that TRAIL-ANG2 fusion proteins bind preferentially to BBB endothelial cells via the TRAIL moiety. Consequently, transport studies indicated that TRAIL-ANG2 fusion proteins can, in principle, be shuttled across BBB endothelial cells, but that low TRAIL receptor expression on BBB endothelial cells interferes with efficient transport. Our work therefore demonstrates that TRAIL-ANG2 fusion proteins remain highly potent in inducing apoptosis, but that therapeutic avenues will require combinatorial strategies, such as TRAIL-R masking, to achieve effective CNS transport.
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    Db-Igs : eine Plattform zur Herstellung multispezifischer Antikörper
    (2020) Seifert, Oliver; Kontermann, Roland E.
    Bi- and multispecific antibodies are designated as the next generation of antibody-based therapy, not least because of their wide therapeutical applications, in particular in the field of immuno-oncology. Here, we present the Db-Ig platform enabling the generation of a variety of IgG-like molecules with varying valency and specificity with great potentials to generate therapeutic antibodies.
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    TRAIL-based multivalent and multifunctional fusion proteins and liposomes for therapeutic applications
    (2014) Seifert, Oliver; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)
    Der aktuelle Stand der klinischen Forschung bietet im Bereich der pro-apoptotischen Rezeptoragonisten, welche die TRAIL-Rezeptoren (TNF-related apoptosis-inducing ligand) ansteuern, für die Krebstherapie bisher keine zufriedenstellenden Ergebnisse. In dieser Doktorarbeit wurde ein therapeutisches Konzept entwickelt, das auf der zielgerichteten und multivalenten Präsentation von ebendiesem TRAIL basiert, und welches eine effektive Induktion des Zelltods in Krebszellen durch die Aktivierung der beiden Todesrezeptoren DR4 und DR5 vorsieht, indem die membrangebundene Form des TRAIL-Moleküls nachgeahmt wird. Folgende zielgerichtete und multivalente TRAIL-Moleküle wurden hergestellt: a) als Dimer angeordnete, zielgerichtete TRAIL-Fusionsproteine durch Verwendung des Homodimerisierungs-Moduls EHD2 (Domäne 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgE), b) zielgerichtete und mit TRAIL-Molekülen modifizierte Liposomen. Darüber hinaus wurde MHD2 (Domäne 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgM) als ein weiteres Homodimerisierungs-Modul genauer untersucht und als Dimer-angeordnete, zielgerichtete und multivalente TNF (Tumor Nekrose Faktor)-Fusionsproteine hergestellt. Durch Fusionierung eines einzelkettigen Antikörper-Fragments (scFv), welches entweder gegen EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR1) oder gegen HER2 (EGFR2) gerichtet ist, an den N- und/oder C-Terminus des MHD2 konnten mono- oder bi-spezifische Antikörper-MHD2-Fusionsproteine hergestellt werden. Diese wiesen einen Aviditätseffekt und eine kooperative Bindung gegenüber Tumorzellen auf. Indem man das MHD2 mit einem einzelkettigen Derivat des TNF (scTNF) modifizierte, konnte ein hexavalentes TNF-Fusionsprotein generiert werden, welches die TNF-Rezeptoren 1 und 2 zu aktivieren vermag und demnach das membrangebundene TNF-Molekül nachahmen kann. Darüber hinaus, wurde durch den scFv-vermittelten Transport des zielgerichteten und multivalenten TNF-Fusionsproteins zu EGFR-positiven Zellen seine Aktivität der TNF-Rezeptor-Aktivierung weiter gesteigert. Durch Fusionierung eines gegen EGFR gerichteten scFv-Fragments an den N-Terminus des EHD2 und eines einzelkettigen Derivats des TRAIL-Moleküls (scTRAIL) an den C-Terminus, konnte ein zielgerichtetes Fusionsprotein hergestellt werden, welches multivalente TRAIL- und scFv-Moleküle präsentiert (scFv-EHD2-scTRAIL). In vitro zeigte sich eine ausgeprägte tumorzellspezifische Induktion des Zelltods für die TRAIL-Fusionsproteine im Vergleich zu den trivalenten scTRAIL-Molekülen: Das scFv-EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein wies sogar eine 8- bis 18-mal stärkere Apoptoseinduktion als das nicht-zielgerichtete EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein auf. Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in einer ausgezeichneten antitumoralen Aktivität im xenografen Colo205 Tumormodell bei Mäusen wieder. Alternativ wurden Liposomen mit TRAIL-Molekülen modifiziert, um diese multivalent präsentieren zu können (LipoTRAIL, LT). Außerdem wurden die TRAIL-funktionalisierten Liposomen mit an EGFR bindenden scFv-Fragmenten ausgestattet (Immuno-LipoTRAIL, ILT), um einen zielgerichteten Transport zu EGFR-positiven Zellen zu ermöglichen. Sie banden spezifisch an EGFR-positive Zellen und induzierten so einen wirksameren Zelltod verglichen mit den LTs. Diese funktionalisierten Liposomen wiesen im Vergleich zum löslichen TRAIL-Molekül eine verlängerte Serumhalbwertszeit auf. Darüber hinaus konnte eine ausgeprägte antitumorale Aktivität der ILT im xenografen Colo205 Tumormodel bei Mäusen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass durch den Einsatz von Fusionsproteinen und funktionalisierten Liposomen, die durch multivalente TRAIL-Moleküle und scFv-Fragmente modifiziert wurden, die Einschränkung der PARA, welche derzeit in klinischen Studien erprobt werden, überwindet werden könnte.
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    Convergence of pathway analysis and pattern recognition predicts sensitization to latest generation TRAIL therapeutics by IAP antagonism
    (2020) Vetma, Vesna; Guttà, Cristiano; Peters, Nathalie; Praetorius, Christian; Hutt, Meike; Seifert, Oliver; Meier, Friedegund; Kontermann, Roland; Kulms, Dagmar; Rehm, Markus
    Second generation TRAIL-based therapeutics, combined with sensitising co-treatments, have recently entered clinical trials. However, reliable response predictors for optimal patient selection are not yet available. Here, we demonstrate that a novel and translationally relevant hexavalent TRAIL receptor agonist, IZI1551, in combination with Birinapant, a clinically tested IAP antagonist, efficiently induces cell death in various melanoma models, and that responsiveness can be predicted by combining pathway analysis, data-driven modelling and pattern recognition. Across a panel of 16 melanoma cell lines, responsiveness to IZI1551/Birinapant was heterogeneous, with complete resistance and pronounced synergies observed. Expression patterns of TRAIL pathway regulators allowed us to develop a combinatorial marker that predicts potent cell killing with high accuracy. IZI1551/Birinapant responsiveness could be predicted not only for cell lines, but also for 3D tumour cell spheroids and for cells directly isolated from patient melanoma metastases (80-100% prediction accuracies). Mathematical parameter reduction identified 11 proteins crucial to ensure prediction accuracy, with x-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and procaspase-3 scoring highest, and Bcl-2 family members strongly represented. Applied to expression data of a cohort of n = 365 metastatic melanoma patients in a proof of concept in silico trial, the predictor suggested that IZI1551/Birinapant responsiveness could be expected for up to 30% of patient tumours. Overall, response frequencies in melanoma models were very encouraging, and the capability to predict melanoma sensitivity to combinations of latest generation TRAIL-based therapeutics and IAP antagonists can address the need for patient selection strategies in clinical trials based on these novel drugs.
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    GlycoTAIL and FlexiTAIL as half-life extension modules for recombinant antibody fragments
    (2022) Seifert, Oliver; Kontermann, Roland E.
    Many therapeutic proteins are small in size and are rapidly cleared from circulation. Consequently, half-life extension strategies have emerged to improve pharmacokinetic properties, including fusion or binding to long-lasting serum proteins, chemical modifications with hydrophilic polymers such as PEGylation, or, more recently, fusion to PEG mimetic polypeptides. In the present study, two different PEG mimetic approaches, the GlycoTAIL and the FlexiTAIL, were applied to increase the hydrodynamic radius of antibody fragments of different sizes and valencies, including scFv, diabody, and scFv-EHD2 fusion proteins. The GlycoTAIL and FlexiTAIL sequences of varying lengths are composed of aliphatic and hydrophilic residues, with the GlycoTAIL furthermore comprising N-glycosylation sites. All modified proteins could be produced in a mammalian expression system without reducing stability and antigen binding, and all modified proteins exhibited a prolonged half-life and increased drug disposition in mice. The strongest effects were observed for proteins comprising a FlexiTAIL of 248 residues. Thus, the GlycoTAIL and FlexiTAIL sequences represent a flexible and modular system to improve the pharmacokinetic properties of proteins.
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    A scDb-based trivalent bispecific antibody for T-cell-mediated killing of HER3-expressing cancer cells
    (2021) Aschmoneit, Nadine; Steinlein, Sophia; Kühl, Lennart; Seifert, Oliver; Kontermann, Roland E.
    HER3 is a member of the EGF receptor family and elevated expression is associated with cancer progression and therapy resistance. HER3-specific T-cell engagers might be a suitable treatment option to circumvent the limited efficacy observed for HER3-blocking antibodies in clinical trials. In this study, we developed bispecific antibodies for T-cell retargeting to HER3-expressing tumor cells, utilizing either a single-chain diabody format (scDb) with one binding site for HER3 and one for CD3 on T-cells or a trivalent bispecific scDb-scFv fusion protein exhibiting an additional binding site for HER3. The scDb-scFv showed increased binding to HER3-expressing cancer cell lines compared to the scDb and consequently more effective T-cell activation and T-cell proliferation. Furthermore, the bivalent binding mode of the scDb-scFv for HER3 translated into more potent T-cell mediated cancer cell killing, and allowed to discriminate between moderate and low HER3-expressing target cells. Thus, our study demonstrated the applicability of HER3 for T-cell retargeting with bispecific antibodies, even at moderate expression levels, and the increased potency of an avidity-mediated specificity gain, potentially resulting in a wider safety window of bispecific T-cell engaging antibodies targeting HER3.