04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von RERE, einem Gen mit möglicher Relevanz bei der Tumorentstehung(2001) Wärner, Thomas Michael; Pfizenmaier, Klaus (Prof.)RERE (RE repeats encoded) ist ein kürzlich beschriebenes Gen welches in der distalen Region von Chromosom 1p lokalisiert ist. Für diese genomische Region wurde durch molekularbiologische und zytogenetische Studien eine konsistente strukturelle Veränderung in verschiedenen menschlichen Tumoren nachgewiesen. Die Neuroblastom Zelllinie NGP enthält eine reziproke chromosomale Translokation/Duplikation in dieser genomischen Region. Die genomische Sequenz von RERE wurde als die den Bruchpunkt überlagernde Sequenz in der Zelllinie NGP nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die genomische Struktur von RERE beschrieben und die cDNA einer neuen RERE Splicevariante isoliert. In allen untersuchten humanen Geweben wurden mittels Northern blotting zwei dominante RERE-Transkripte nachgewiesen und diese als mögliche Splice Varianten identifiziert. Darüber hinaus wurde in allen untersuchten Tumorzelllinien mittels Western blotting zwei dominante Proteinbanden mit einem RERE Immunserum nachgewiesen. In 2 von 18 untersuchten Tumorzelllinien wurde zusätzlich jeweils eine kleinere dominante Proteinbande detektiert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß überexprimiertes RERE in PML Oncogenic Domains (PODs) lokalisiert ist und mit den pro-apoptotischen Proteinen PML, BAX und mit Mitochondrien kolokalisiert. Bei RERE transfizierten Zellen wurde durch unterschiedliche Methoden Apoptose nachgewiesen. Durch die Untersuchung verschiedener RERE Proteinfragmente (gesamtes RERE und N- oder C-terminale Deletionsmutanten von RERE) konnte die Region beschrieben werden, die eine Kolokalisierung von RERE und PODs unterstützt und nachdem sie in verschiedene Zelllinien transfiziert wurde, mit dem Nachweis von Apoptose korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen ersten Hinweis auf die Funktion von RERE. RERE könnte eine Verbindung zwischen PODs und der Kontrolle von Apoptose darstellen und somit eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen.Item Open Access Molekulare Mechanismen der Antiöstrogenwirkung beim Mammakarzinom(2002) Buck, Miriam; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Antiöstrogene haben sich als sehr effektiv in der Behandlung hormon-responsiver Mammakarzinome erwiesen. Im Verlauf der Therapie kommt es jedoch in der Regel zu einem Verlust der anithormonellen Wirkung. Die an der Entstehung der Antihormonresistenz beteiligten Mechanismen sind weitgehend ungeklärt. Ein entscheidender Schritt zur Aufklärung der antihormonellen Wirkung war die Beobachtung, dass die Behandlung hormonsensitiver Mammakarzinomzellen zu einer Aktivierung des inhibitorischen Wachstumsfaktors TGFb führt. Am Modell-System hormon-sensitiver MCF-7 Mammakarzinomzellen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Beteiligung des TGFb-Systems an der Wirkung des nicht-steroidalen, partiellen Antiöstrogens 4-Hydroxytamoxifen und des steroidalen, reinen Antiöstrogens ICI 182.780 untersucht. Die Ergebnisse sollen zum besseren Verständnis der Interaktionen zwischen Hormonen und Wachstumsfaktoren und den damit im Zusammenhang stehenden Mechanismen der Antiöstrogenresistenz beitragen. Im Mittelpunkt des ersten Teils der Arbeit stand die antiöstrogene Regulation des TGFb-Systems. Untersucht wurde die Expression der Liganden TGFb1 und TGFb2, der Rezeptoren TbRI und TbRII und von Smad7. Zur genauen Quantifizierung der mRNA-Expression dieser Gene wurden spezifische LightCycler RT-PCRs etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur TGFb2 sondern auch TbRII einer antihormonellen Regulation unterliegt. Die Stärke der Induktion beider Gene korrelierte mit der wachstumsinhibitorischen Wirkung der Antiöstrogene. Smad7 wurde nur schwach durch Antiöstrogen induziert, TGFb1 und TbRI gar nicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht Aufschluss darüber zu erhalten, welche Zweige des komplexen TGFb Signaltransduktionssystems an der antiöstrogenen Wirkung beteiligt sind. Als Endpunkt wurde u.a. die Aktivierung TGFb-sensitiver Promotoren untersucht. Das Reporterplasmid p3TP-lux wurde durch Antiöstrogene ca. 2fach stärker aktiviert als durch TGFb. Über Koexpression dominant-negativer TGFb-Rezeptoren und dominant-negativer Smad4-Proteine konnte gezeigt werden, dass die anitöstrogene Aktivierung von p3TP-lux TGFb vermittelt ist und über den Smad-Signaltransduktionsweg verläuft. Obwohl das steroidale Antiöstrogen ICI 182.780 einen deutlich stärkeren Effekt auf das TGFb-System hat als das partielle Antiöstrogen 4-Hydroxytamoxifen, war die Aktivierung von p3TP-lux durch beide Antiöstrogene annähernd gleich stark. Für eine vollständige Aktivierung von p3TP-lux ist eine Kooperation zwischen einem TGFb aktivierten Smad-Komplex und c-Jun/c-fos notwendig. Die Induktion von c-fos wird jedoch durch steroidale Antiöstrogene blockiert und kommt daher als Ursache der geringen Induktion von p3TP-lux durch ICI 182.780 in Frage. Da TGFb seine Wirkung neben dem Smad-Signaltransduktionsweg auch über MAP-Kinase-Wege entfalten kann, wurde mit Hilfe spezifischer pharmakologischer Inhibitoren die Beteiligung des MEK/Erk- und des p38-MAP-Kinase-Weges an der antihormonellen Wachstumsinhibition untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der p38-Weg über die Induktion von TGFb2 und TbRII an der antihormonellen Wachstumsinhibition beteiligt ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Antiöstrogene verschiedene Gene des TGFb-Signaltransduktionssystems differenziell regulieren. Die Untersuchungen zur Beteiligung der TGFb-Signaltransduktionswege an der antihormonellen Wirkung weisen darauf hin, dass diese differenzielle Regulation, durch die spezifische Aktivierung einiger TGFb-Signaltransduktionswege (Smad, p38) und gleichzeitige Inhibition anderer (MEK/Erk) erreicht wird. Da die Signaltransduktionswege in unterschiedlichem Ausmaß zur Aktivierung der verschiedenen Promotoren beitragen, kommt es unter Antiöstrogeneinfluss zu einer Modifizierung des TGFb induzierten Genexpressionsmusters und der spezifisch antiöstrogenen Wirkung.Item Open Access Hemmung von Bcr/Abl durch Imatinib führt zu einer Cisplatin-Sensitivierung und zu einer modulierten p53-Funktion bei Bcr/Abl-positiven Zellen(2009) Skorta, Ioanna; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Für die Pathogenese der chronisch myeloischen Leukämie (CML) ist die onkogene Kinaseaktivität von Bcr/Abl essentiell. Aufgrund der Tatsache, dass Bcr/Abl selektiv in malignen Zellen exprimiert wird und diese onkogene Tyrosinkinase kausal für die CML ist, stellt dieses Fusionsprotein einen hervorragenden Angriffspunkt für eine zielgerichtete Behandlung der Krankheit dar. Seit der Einführung im Jahr 2001 hat sich der Bcr/Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib Mesylat (Glivec®; GleevecTM; STI571) zum Goldstandard in der Primärtherapie der CML etabliert. Obwohl bisher große therapeutische Erfolge mit Imatinib bei Patienten mit CML in chronischer Phase erzielt werden konnten, ist nach aktuellem Erkenntnisstand keine Eliminierung aller leukämischen Zellen durch eine Imatinib-Monotherapie in Patienten möglich. Die Entwicklung neuer Behandlungs-Strategien, die eine vollständige Heilung der CML erzielt, ist nach wie vor von großer Bedeutung. Erfolgversprechend könnte die Kombination aus Imatinib und anderen Medikamenten, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, sein. In der vorliegenden Dissertation gelang erstmalig der Nachweis, dass eine Behandlung mit Imatinib zu einer Hypersensitivität gegenüber Cisplatin führt sowohl bei murinen Bcr/Abl positiven Zellen als auch in primären Philadelphia- positiven Progenitor-Zellen aus CML Patienten, die in diesem Ausmaß bisher nicht beschrieben wurde. Die Kombination aus Imatinib und Cisplatin führte bei Bcr/Abl-positiven Zellen zu einer extrem verstärken Induktion von Zelltod, während dieselbe Behandlung keine zusätzlichen Effekte bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte der durch eine Imatinib/Cisplatin- Behandlung vermittelte Viabilitätsverlust durch eine zusätzliche Inkubation mit dem Mdm2-Antagonisten Nutlin weiter verstärkt werden, sodass im Zellliniensystem ein fast 100 %-iger Zelltod und bei primären Zellen eine fast komplette Hemmung der Koloniebildung erreicht wurde. Interessanterweise ergab ein Vergleich der Cisplatin-Sensitivität der Bcr/Abl-positiven Zelllinie BaF3p185 in Anwesenheit von Imatinib mit der von anderen Tumorzelllinien, dass durch Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen eine Sensitivität erreicht wurde, die vergleichbar mit der extrem sensitiven Hodenzelllinie N-TERA war. Zur Charakterisierung möglicher Ursachen dieser Hypersensitivität Imatinib- behandelter CML Zellen gegenüber Cisplatin, wurden zunächst mögliche Alterationen der Regulation des Zellzyklusarrests nach Cisplatin-Behandlung untersucht. Cisplatin induzierte sowohl bei Bcr/Abl-positiven als auch bei Bcr/Abl-negativen Zellen einen G2/M-Arrest. Durch die Behandlung mit Imatinib kam es zu einem Verlust des G2/M-Arrests und zu einer schnellen Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen, während dieselbe Behandlung keinen Effekt auf den Cisplatin-induzierten G2/M-Arrest bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte mittels einer Analyse der einzelnen Zellgenerationen 24 h nach Cisplatin-Behandlung gezeigt werden, dass Bcr/Abl-positive Zellen bereits nach der ersten Zellteilung in der G2/MPhase arretierten und eine kleine Zellpopulation, vermutlich nach erfolgter Reparatur des DNASchadens, ohne signifikanten Verlust der mitochondrialen Integrität, eine dritte Zellteilung vollendet hatte. In Anwesenheit von Imatinib hingegen waren die Zellen nicht in der Lage in G2/M zu arretieren. Vielmehr kam es bereits nach der ersten Zellteilung zum Verlust der mitochondrialen Integrität infolge von Cisplatin. Es ist bekannt, dass es durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zur Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium und damit zu einem Caspase-abhängigen Todesmechanismus kommt. Interessanterweise verlief der Imatinib/Cisplatin-induzierte Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen unabhängig von Caspasen. Neben Cytochrom C wird auch AIF aus dem Mitochondrium freigesetzt, das in der Lage ist einen Caspase-unabhängigen Todesmechanismus zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es in Bcr/Abl-positiven Zellen infolge einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer AIFTranslokation in den Zellkern und somit zur Induktion von Zelltod kam. Als mögliche Ursache für den Verlust des G2/M-Arrests konnte eine verminderte ATMAktivierung infolge einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung selektiv bei Bcr/Abl-positiven Zellen identifiziert werden. Die verminderte Aktivierung von ATM führte zu einer Reduktion der p53-Phosphorylierung an Serin 15 und zu einer leichten Reduktion der p53-Induktion nach Cisplatin-Behandlung. Die verminderte p53-Phosphorylierung an Serin 15 hatte Konsequenzen auf die durch zellulären Stress hervorgerufene p53-Antwort, wobei es zu einer verminderten transkriptionellen Aktivität von p53 kam. Dies konnte durch die reduzierte Expression der p53-Zielstukturen, Mdm2 und p21, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene, gezeigt werden. Im Gegensatz zu Mdm2 und p21 waren die proapoptotischen p53-abhängigen Gene wie BAX, PUMA und NOXA bereits in Abwesenheit von zellulärem Stress hoch exprimiert und wurden durch eine Behandlung mit Cisplatin nicht weiter induziert. Auch eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit Imatinib hatte keine Auswirkungen auf die Expression von BAX, PUMA und NOXA. Demnach hat p53 auch keine transaktivierende Wirkung auf diese proapoptotischen Gene in diesem Zellsystem nach einer Behandlung mit Cisplatin. Dies bedeutet, dass die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor durch eine Behandlung mit Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen gestört war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte dennoch gezeigt werden, dass p53 für den hypersensitiven Phänotyp, der bei Bcr/Abl-positiven Zellen durch eine Imatinib/Cisplatin-Behandlung induziert wird, eine entscheidende Rolle spielt. p53 hat neben seiner Funktion als Transkriptionsfaktor im Zellkern auch im Zytoplasma eine wichtige Zelltod-induzierende Funktion. Im Zytoplasma ist p53 in der Lage durch die Bindung an pro- und antiapoptotische Proteine, unabhängig von seiner transkriptionellen Aktivität, BAX zu aktivieren und somit Zelltod zu induzieren. Voraussetzung für die Ausübung dieser Funktion ist eine Lokalisation von p53 im Zytoplasma. In dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass p53 nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung Bcr/Abl-positiver Zellen größtenteils im Zytoplasma akkumuliert. Der p53-Export aus dem Zellkern wird vermittelt durch eine verminderte p53-Phosphorylierung am Serin-Rest an Stelle 15, durch eine niedrige Mdm2-Proteinmenge und durch die Aktivierung von FoxO3a. Alle drei Mechanismen konnten in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Demnach wird die rasche Induktion von Zelltod durch zytoplasmatisches p53 vermittelt. Im Zytoplasma interagiert p53 mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-xL, wodurch eine Aktivierung von BAX durch p53 und somit die Induktion von Zelltod verhindert wird. Es konnte gezeigt werden, dass es selektiv bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer signifikanten Reduktion der Bcl-xL-Expression kam. Diese verminderte Expression von Bcl-xL führte wahrscheinlich zu einem Ungleichgewicht zwischen Bcl-xL und p53 zugunsten von p53, sodass vermehrt “freies“ p53 im Zytoplasma vorlag, das dann in der Lage war, BAX zu aktivieren und einen mitochondrialen Zelltod zu induzieren. Die entscheidende Rolle der verminderten Bcl-xL Expression für den hypersensitiven Phänotyp konnte dadurch belegt werden, dass eine exogene Expression von Bcl-xL, die das Gleichgewicht mit p53 wiederherstellte, ausreichend war, um den Verlust der mitochondrialen Membranintegrität und die Translokation von AIF zu verhindern. Die Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung konnte dadurch signifikant reduziert werden. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass für die Induktion einer Tumorselektiven Hypersensitivität gegenüber Cisplatin zwei Signalwege von entscheidender Bedeutung sind. Durch die Hemmung des ATM/p53-Signalwegs sind Bcr/Abl-positive Zellen nicht mehr in der Lage, in der G2/M-Phase zu arretieren. Darüber hinaus vermittelt eine Cisplatin-Behandlung in Anwesenheit von Imatinib die Akkumulation von p53 im Zytoplasma und eine gleichzeitige Reduktion der Bcl-xL-Expression, was zu einer massiven Induktion von Zelltod führt. Die Befunde dieser Arbeit könnten auch für andere maligne Erkrankungen bedeutend sein. Aufgrund der Tatsache, dass bei vielen Tumoren Signalwege der DNA-Schadensprozessierung per se dereguliert sind, könnte die pharmakologische Hemmung eines weiteren Wegs zu einer vergleichbaren Hypersensitivität führen, wie sie in vorliegender Dissertation nach Hemmung der ATM/p53-Achse und der Bcl-xL-Expression beobachtet wurde. Da bei normalen Zellen durch diesen pharmakologischen Eingriff lediglich ein Weg gehemmt würde, der andere jedoch weiterhin intakt wäre, wäre diese Hypersensitivität tumorselektiv.Item Open Access Molekulare Mechanismen der pro-apoptotischen Kooperation zwischen TNF-R1 und Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie(2002) Fotin-Mleczek, Mariola; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der apoptotischen Kooperation zwischen dem Todesrezeptor TNF-R1 und den Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie, insbesondere dem TNF-R2, aufzuklären. Es wurde hier gezeigt, dass die Art der zellulären Antwort, die vom TNF-R1 ausgeht, stark von der Dauer der TNF-Stimulation abhängen kann. So reicht ein TNF-Puls aus um den Transkriptionsfaktor NF-kB zu aktivieren, ist aber nicht hinreichend, um die apoptotische Zellmaschinerie in Gang zu setzen. Die Ko- und Vorstimulation des TNF-R2 konnten die TNF-vermittelte Apoptose-Induktion erhöhen und beschleunigen. Die Verstärkung der Apoptose korrelierte dabei mit der Zeitkinetik der TNF-R2-induzierten TRAF2-Depletion. Eine TNF-R2-Stimulation von 6 Stunden führte zu einer fast vollständigen Depletion von TRAF2 aus dem Zytoplasma, verstärkte den TNF-R1-vermittelten Zelltod dramatisch und inhibierte gleichzeitig die TNF-R1-induzierte NF-kB-Aktivierung zu 90%. Wurden die beiden TNF-Rezeptoren gleichzeitig aktiviert, so konnte noch immer eine beträchtliche Verstärkung der TNF-R1-induzierter Apoptose beobachtet werden, während die TNF-R1-vermittelte NF-kB-Aktivierung unbeeinflusst blieb. Mit Hilfe von der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Stimulation der Nicht-Todesrezeptoren CD40 und TNF-R2 zur TRAF2-abhängigen Rekrutierung der anti-apoptotischen Moleküle cIAP1 und cIAP2 an die Rezeptoren führte. Dies zeigt, dass der TNF-R1 und die Nicht-Todesrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie nicht nur um TRAF2 sondern auch um die mit TRAF2 assoziierten Schutzproteine kompetieren können. Diese Kompetition bildet den Kern des Modells zur apoptotischen Kooperation der beiden TNF-Rezeptoren. Demnach kann die Stimulation des TNF-R2 die TNF-R1-induzierte Apoptose auf zwei Ebenen verstärken: über die Inhibierung der NF-kB-abhängigen Induktion von Schutzproteinen und durch die Inhibition ihrer Schutzwirkung auf der post-transkriptionellen Ebene durch Kompetition. In beiden Fällen wird die Ausbildung eines Caspase-8-aktivierenden TNF-R1-Signalkomplexes ermöglicht. In vivo werden die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie auch durch membranständige Liganden aktiviert. Daher wurden im zweiten Abschnitt dieser Arbeit die Interaktionen zwischen TNF-R2, CD40 und ihren membranständigen Liganden analysiert. Unter Anwendung der Laser-Scanning-Mikroskopie und von Kokulturen konnte demonstriert werden, dass in Zell-Zell-Kontakten die Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie mit ihren membranständigen Liganden Superaggregate bilden. Diese Aggregate entstehen innerhalb von 30 Minuten nach dem Zusammentreffen zweier Zellen, von denen eine den Rezeptor und die andere den membranständigen Ligand exprimiert. Die Rezeptor-Ligand-Superaggregate bleiben über mehrere Stunden stabil, wobei sich ihre Form und Lage stets verändern. Im Weiterem wurde beobachtet, dass die Rezeptor-Ligand-Superaggregate signalfähige Rezeptor-Komplexe enthalten. So wurde z.B. TRAF2 in die TNF-R2/memTNF-Aggregate rekrutiert. Wurde der CD40 mit einem löslichen CD40-Ligand stimuliert, so wurde die Internalisierung und möglicherweise der Abbau des Rezeptors beobachtet, nicht jedoch nach der Stimulation mit dem membranständigen Ligand. Dies deutet darauf hin, dass sich die Qualität der Bindung zwischen dem Rezeptor und seinem membranständigen Liganden wesentlich von der Interaktion des Rezeptors mit den löslichen Reagenzien unterscheidet.Item Open Access Charakterisierung der Regulation der gerichteten Migration und Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen durch den neuronalen Wachstumsfaktor GDNF(2002) Veit, Christine; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Die starke Infiltration intra- und extrapankreatischer peripherer Nerven gilt als Hauptursache für das Auftreten lokaler Rezidive und die äußerst schlechte Prognose von exokrinen Pankreaskarzinomen. Die hohe Affinität der Tumorzellen zu peripherem Nervengewebe und die bereits in frühen Tumorstadien einsetzende perineurale Invasion machen eine spezifische Interaktion zwischen den Pankreaskarzinomzellen und den peripheren Nerven wahrscheinlich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher nach Signalmolekülen gesucht, die an der Induktion der perineuralen Invasion humaner Pankreaskarzinomzelllinien beteiligt sein könnten. Der Einfluss konditionierter Medien neuronaler und glialer Zellen sowie spezifischer rekombinanter neuronaler Faktoren auf die Proliferation und Chemotaxis humaner Pankreaskarzinomzelllinien wurde analysiert. Hierbei wurde der neurotrophe Faktor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) als Chemotaxis-induzierender Faktor für PANC-1-Zellen identifiziert. Da GDNF bei neuronalen Zellen seine spezifische Wirkung durch Bindung an den GDNF-Rezeptor-Komplex entfaltet, wurde die Expression dieses Rezeptor-Komplexes, bestehend aus der Rezeptortyrosinkinase Ret und dem GPI-Anker-Protein GFRa, in PANC-1-Zellen nachgewiesen. Mittels RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion)- und Western blot-Analysen konnte die Expression der beiden GDNF-Rezeptor-Komponenten Ret und GFRa1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene demonstriert werden. Eine nähere Charakterisierung des GDNF-Rezeptor-Komplexes in PANC-1-Zellen durch RT-PCR-Analysen ergab, dass die Transkripte von zwei GFRa-Proteinen, GFRa1 und GFRa2, und den drei bekannten Ret-Isoformen, Ret9, Ret43, Ret51, in PANC-1-Zellen nachweisbar sind. Durch Sequenzanalyse des Ret51-Transkriptes aus PANC-1-Zellen konnte die Expression der wildtypischen Sequenz in diesen Zellen bestätigt werden. Nachfolgend wurde die vollständige kodierende Ret51-DNA-Sequenz in den pEGFP-N1-Vektor kloniert und die Expression der Ret-EGFP-Fusionsproteine in PANC-1- und HEK293-Zellen in Fluoreszenz- und Western blot-Analysen überprüft. Zur Untersuchung Ret-abhängiger Signaltransduktionswege in PANC-1-Zellen wurden Ras- und Rac-GTP-Präzipitationsversuche und Kinaseaktivitätsanalysen der MAP-Kinasen ERK2 und JNK anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit GDNF zu einer Steigerung der N-Ras- und Rac-GTP-Menge in PANC-1-Zellen führt und die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK induziert. Durch Migrationsexperimente in Anwesenheit des MEK1-Inhibitors PD98059 und des PI3-Kinase-Inhibitors LY294002 konnte die Relevanz der Ras- Raf-MEK-ERK-Kaskade und der PI3-Kinase für die gerichtete Migration von PANC-1-Zellen herausgestellt werden. Um den Einfluss verschiedener Rho-Proteine auf Migrations- und Invasionsprozesse humaner Pankreaskarzinomzelllinien analysieren zu können, wurde die RhoC-cDNA-Sequenz aus BxPC-3-Zellen amplifiziert und PANC-1-Zellklone generiert, welche EGFP-RhoC- oder EGFP-RhoA-Fusionsproteine stabil überexprimieren. Das Migrationsverhalten dieser Zellklone wurde im Boyden-Kammer-System analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass die Expression von EGFP-RhoC im Gegensatz zu EGFP-RhoA zu einer deutlichen Steigerung der Chemotaxis bei PANC-Zellen führt. Somit wurden entscheidende molekulare Mechanismen aufgedeckt, die für die GDNF-induzierte Migration von PANC-1-Zellen relevant sind. Es wäre darüber hinaus möglich, dass das GDNF/Ret/GFRa-System sowie die kleine GTPase RhoC an der perineuralen Invasion von Pankreaskarzinomzellen in vivo beteiligt sind.Item Open Access Funktionelle Charakterisierung und in silico-Modellierung LPS-induzierbarer Elemente des RANTES-Promotors in humanen Monocyten(2001) Fessele, Sabine; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Das proinflammatorische CC-Chemokin RANTES kann von einer Vielzahl von Geweben als Reaktion auf entsprechende Stimuli produziert werden. Die gewebespezifische Transkription ergibt sich aus der räumlichen Anordnung verschiedener cis-regulatorischer Elemente in der Promotorsequenz und der Anwesenheit von bestimmten Transkriptionsfaktoren. Humane Monocyten produzieren RANTES konstitutiv in geringen Mengen. Stimulation mit LPS führte in diesem Zelltyp zu einer schnellen und transienten Verstärkung der RANTES-Transkription. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Regionen untersucht, die an dieser Transkriptionsaktivierung beteiligt sind. Die Elemente wurden mit Hilfe von DNase I footprinting-Analysen und EMSA-Experimenten, sowie der transienten Transfektion von Reportergenkonstrukten charakterisiert. Die Region E des RANTES-Promotors (R(E), -125/-99) zeigte in den Monocyten-Zellinien MM6 und THP-1 konstitutive Bindung von Mitgliedern der C/EBP-Familie. Die Mutation der C/EBP-Bindungssequenz in R(E) führte in beiden Zelltypen zu einer um 40-50 % verminderten LPS-induzierten Reporteraktivität. Die Region R(AB) (-73/-34) besteht aus den NF-kB-ähnlichen Elementen R(A) und R(B). Diese beiden Elemente bilden zusammen ein LPS-induzierbares Promotor-Modul. R(A) bindet konstitutiv Sp1 und, nach Stimulation mit LPS, Rel-p50/p65-Heterodimere. Beide Faktoren können an R(A) transkriptionsaktivierend wirken. Für die Stimulation der RANTES-Transkription durch LPS ist zusätzlich das induzierte Binden von Rel-p50/p50-Homodimeren an R(B) erforderlich. Die experimentell gewonnenen Daten wurden verwendet, um eine Reihe von Computermodellen zu erstellen. Diese Modelle sollten die Grundstruktur einer durch LPS regulierbaren Promotorsequenz beschreiben. Mit Hilfe dieser Modelle konnten in Datenbanksequenzen andere Promotorbereiche gefunden werden, die ebenfalls durch LPS reguliert werden können. Ferner wurden Kandidatengene für eine transkriptionelle Regulation durch LPS identifiziert.Item Open Access Generation and characterization of CD40-Flag-FasL : a novel Fas agonist devoid of systemic toxicity(2005) Assohou-Luty, Constance; Wajant, Harald ( Prof. Dr.)Soluble single chain antibody fusion proteins incorporating the extracellular domains of human TNF, FasL or TRAIL acquire functional properties similar to those of their corresponding membrane-bound forms, following interaction with surface antigens expressed by target cells. In this work, this principle is extended to include other selective protein-protein interactions. Soluble fusion proteins comprising, at the N-terminus, the extracellular domains of human CD40, 4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK and, at the C-terminus, the extracellular domain of human FasL were generated. CD40 was also fused to the extracellular domain of human TRAIL. In all cases the two domains were separated by the Flag sequence to facilitate the detection and purification of the fusion proteins, and all the DNA constructs had a leader sequence to target the resulting proteins to the secretory pathway. The proteins had MWs over the expected sizes, a tendency that was particularly striking for RANKed-Flag-FasL and CD40-Flag-FasL, probably due to post-translational modifications such as glycosylation. The proteins were subsequently analysed for their soluble FasL-like activity on HT1080 cells. Despite only moderate expression or barely detectable expression in the cases of TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL and TNFR2-Flag-FasL, these proteins showed high specific activities. In sharp contrast to the above mentioned fusion proteins, supernatants of CD40-Flag-FasL and RANKed-Flag-FasL, which contained much more protein, showed very low and low specific activity, respectively. Since the activity of soluble FasL can be increased through multimerization (Schneider et al, 1998), the proteins were cross-linked via their internal Flag-tag. Surprisingly, it led to a decrease in activities for TNFR1-Flag-FasL, TNFR2-Flag-FasL and 4-1BB-Flag-FasL. The activity of RANKed-Flag-FasL could be increased by a factor of 50-100 but the cell death-inducing capacity of CD40-Flag-FasL was virtually unchanged by artificial cross-linking. The high specific activity observed for TNFR1-Flag-FasL, 4-1BB-Flag-FasL and TNFR2-Flag-FasL was thus likely the result of the presence of significant amounts of higher MW aggregates of homotrimers in the supernatants. RANKed-Flag-FasL was probably mostly non-aggregated and was therefore activated upon cross-linking. The lack of any M2 cross-linking antibody-mediated effect in the case of CD40-Flag-FasL does not indicate a defect in the FasL part of the protein but might rather reflect, for example, steric hindrance of the M2 antibody. RANKed-Flag-FasL and CD40-Flag-FasL were thus subsequently further analysed with respect to their capacity for target-dependent activation. CD40-Flag-FasL was stably expressed in HEK293 cells and then affinity purified from supernatants of the stable cells. Western blotting analysis showed that CD40-Flag-FasL migrated with a MW of ~50 kDa under reducing conditions however, analysis of the native protein by gel filtration showed that CD40-Flag-FasL eluted with an apparent MW of 471 kDa, corresponding to a 9.4 mer but this is likely to be an overestimation as CD40-Flag-FasL behaved like a homotrimeric molecule. Binding experiments showed that CD40-Flag-FasL could be immobilized specifically by CD40L-expressing cells and, furthermore, that upon binding it induced clustering of Fas on neighboring cells. CD40-Flag-FasL induced apoptosis and NFkappaB activation in a concentration-dependent manner in transfected HT1080 and KB cells expressing CD40L and not in parental cells, despite similar sensitivities of both parental and transfectant cells to cross-linked FasL. When RANKed-Flag-FasL was analysed in a setting allowing target antigen-mediated immobilization, the protein led to gene induction in a RANKL-dependent manner. The EC50 of CD40-Flag-FasL was shown to be ~ 4 logs lower in HT1080-CD40L compared to HT1080 cells. Cell death induced in CD40L-positive cells was accompanied by cleavage of pro-caspase-8 and activation of caspase-3 and could be completely inhibited by zVAD, Fas-Comp or an anti-human CD40L antibody. CD40-Flag-FasL induced apoptosis in a paracrine manner on by-stander cells and proved to be safe when assayed in vivo in mice for acute toxicity, whereas artificial cross-linking of CD40-Flag-FasL induced liver failure in a concentration-dependent fashion. The promising results obtained with CD40-Flag-FasL led to the cloning of a CD40-Flag-TRAIL construct that was shown to be capable of inducing both apoptosis and NFkappaB in a CD40L-dependent manner. CD40-Flag-TRAIL-mediated apoptosis was shown to be TRAIL-specific, to result from the interaction between CD40/CD40L, and to occur via interaction with TRAIL-R2 in both KB-CD40L and HT1080-CD40L cells. These promising results provide the basis for relatively simple development of safer i.e. less toxic FasL or TRAIL derivatives for the treatment of a variety of human pathologies.Item Open Access Identification of novel protein binding partners for the tumor suppressor DLC1(2009) Heering, Johanna; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Cancer, one of the major chronic health problems worldwide, is a genetic disease, which requires the cooperation of gain-of-function and/or loss-of-function mutations to either oncogenes or tumor suppressor genes, respectively. In the last decade, the Deleted in Liver Cancer (DLC) 1 gene has emerged as a novel tumor suppressor downregulated in a variety of cancer types including breast, liver, prostate and lung. DLC1 is a multidomain protein consisting of an N-terminal sterile alpha motif (SAM), a C-terminal START and an internal Rho GTPase activating (GAP) domain. Due to GAP-dependent and -independent mechanisms that are still poorly understood DLC1 is able to inhibit proliferation, migration and invasion of tumor cells. The goal of this thesis was the identification of novel DLC1 protein binding partners, in order to gain deeper insight into DLC1 regulation and molecular function. Therefore, a yeast-two-hybrid screen based on the Gal4-system was performed, using the DLC1 SAM domain as a bait and a cDNA library derived from human breast tissue as a prey. One of the 16 putative binding candidates identified was the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN), which is also a tumor suppressor frequently deleted or mutated in sporadic tumors of the breast, prostate, endometrium and brain. PTEN consists of an enlarged catalytic site that acts as a dual-specificity phosphatase for proteins and lipids. By dephosphorylation of its major lipid substrate phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) the PI3K signaling pathway is downregulated and cell proliferation and survival mediated by Akt/PKB activation are inhibited. Cell spreading and cell motility are also suppressed by PTEN activity. Pulldown assays and coimmunoprecipitation of DLC1 and PTEN confirmed association of the proteins in mammalian cells. The interaction of both proteins was stimulated upon PTEN activation by PDGF treatment, correlating with their colocalization at the plasma membrane. In overexpression experiments synergistic effects of the two proteins with regard to downstream signaling could not be observed. However, simultaneous loss of DLC1 and PTEN in the non-invasive MCF7 breast carcinoma cell line using RNA interference enhanced migration in an additive manner in wounding as well as in chemotactic transwell assays compared to singly depleted cells. These results suggest that the spatio-temporally restricted formation of a DLC1/PTEN complex, simultaneously inhibiting its individual downstream targets, guarantees the synchronization of cell migration processes. Thus, loss of both proteins is proposed to facilitate malignant transformation by increasing the metastatic potential of tumor cells. Another putative DLC1 binding partner identified in the yeast-two-hybrid screen was liprin beta2 that belongs to a protein familiy comprising four alpha- and two beta-type family members, which all contain a C-terminal highly conserved liprin homology (LH) domain consisting of three SAM domains. Association of full-length DLC1 with liprin beta2 as well as with the additional family members liprin alpha1 and beta1 was confirmed biochemically by coimmunoprecipitation. Liprins are multivalent proteins that form complex structures due to homo- and heterodimerization. Additionally, alpha-type liprins interact with the LAR subfamily of receptor protein-tyrosine phosphatases, which are heterophilic receptors involved in cell adhesion and cell motility. Given the function of liprins as adaptor proteins at membrane proximal sites, it is conceivable that they contribute to DLC1 localization and/or scaffolding. It is thus of particular interest to investigate the biological impact of DLC1 binding to liprin proteins in future studies.Item Open Access Analysis of molecular components essential for the formation of signaling competent TNF-TNFR complexes(2007) Branschädel, Marcus; Scheurich, Peter ( Prof. Dr.)Signaling of Tumor Necrosis Factor Receptors (TNFR) coincides with the formation of microscopically visible aggregates. At least two interactions are required for such cluster formation: One ligand-dependent, and one ligand-independent. The second type of interaction was investigated by using chimeric receptors consisting of TNFR1 or TNFR2 that were fused to the intracellular parts of Fas. These molecules were used as a model system to analyze the role(s) of the extracellular cysteine rich domains (CRDs) as well as the stemand transmembrane regions during signal formation. Whereas CRD2 and -3 directly contact the ligand within a signaling-competent complex, the CRD1 has several roles: It is a scaffold for CRD2, necessary for receptor-receptor interactions without ligand and essential for the formation of signaling competent complexes after ligand binding. In addition, the exchange of the CRD1 between receptors revealed that this domain also contributes to the discrimination of soluble versus membrane-bound ligand. Furthermore, the stem- and transmembrane regions influence the chemical reactivity towards the homo-bifunctional crosslinker BS3. The amount of cross-linkable receptors may be indicative for the strength of a homophilic receptor-receptor interaction that, together with the half-times of the ligand-receptor interaction, determine the generation of an intracellular signal. The experimental data are summarized into a hypothetical model of a ligand-induced hexagonal lattice of ligand-receptor complexes. Such a pattern would allow the efficient activation of intracellularly recruited and enzymatically active proteins (e.g. kinases and caspases) as these are believed to require a dimerization for activation, although ligands of the TNF family display a three-fold symmetry.Item Open Access Targeted lipid coated nanoparticles : delivery of tumor necrosis factor functionalized particles to tumor cells(2009) Messerschmidt, Sylvia; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)Polymeric nanoparticles become more and more important as versatile carrier systems for therapeutic and diagnostic compounds embedded within the particle matrix or attached to the particle surface through physical or covalent bonds. Nanoparticle displaying tumor necrosis factor (TNF) on their surface, efficiently activate both TNF receptors and thus mimic the bioactivity of membrane-bound TNF. This leads to a strikingly increased apoptosis. However, an in vivo application for cancer therapy is hampered by the potential systemic action of TNF, which can lead to severe side effects and even death. In this study, targeted lipid-coated TNF-functionalized nanoparticles (scTNF-TLP) were generated, which may be a promising formulation of TNF enabling a systemic and tumor selective application. ScTNF-TLP are composed of an inner polymeric core with a surface that is functionalized with a single-chain TNF derivative (scTNF). The particles are surrounded by a sterically stabilized polyethylene glycol (PEG)-lipid coat. Thus a strong reduction of the cytotoxic effect could be achieved which indicates an effective shielding of the TNF activity. By insertion of a single-chain Fv fragment (scFv) directed against the tumor stroma marker fibroblast activation protein (FAP) an active targeting could be demonstrated. The insertion of the targeting moiety into the lipid coat was achieved by a defined and site-directed coupling through a genetically engineered cysteine residue. In order to improve the scFv format for coupling a comparative analysis of various newly designed variants was performed. The most suitable variants contain the hexahistidyl-tag for purification and detection incorporated into the linker sequence together with a cysteine residue (LCH). The resulting TLP and scTNF-TLP bound specifically to FAP-expressing cells but not to FAP-negative cells. The lipid-coating strongly reduced the unspecific uptake of particles and also the scTNF-P mediated apoptosis. In contrast, an increased cytotoxicity towards FAP-expressing cells could be shown for anti-FAP scTNF-TLP compared to lipid-coated scTNF-P without targeting molecule. This indicates a selective delivery of the embedded TNF-functionalized nanoparticle to antigen-positive target cells. In summary, by encapsulation into a multifunctional lipid-shell, polymeric and TNF-functionalized nanoparticles, which are subject to an unspecific activity towards a variety of cells and tissue, could be converted in a targeted lipid-coated nanoparticulare carrier system and demonstrated a target cell-specific action of the bioactive compound. This system benefits from a large modularity: beyond the bioactive compound also the targeting moiety as well as the inner core could be adapted at the current requirements. Thus, a manifold application as imaging or drug carrier system is conceivable. Moreover, a combination of both approaches enables usage for a diagnostic as well as therapeutic application.