04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Hemmung von Bcr/Abl durch Imatinib führt zu einer Cisplatin-Sensitivierung und zu einer modulierten p53-Funktion bei Bcr/Abl-positiven Zellen(2009) Skorta, Ioanna; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Für die Pathogenese der chronisch myeloischen Leukämie (CML) ist die onkogene Kinaseaktivität von Bcr/Abl essentiell. Aufgrund der Tatsache, dass Bcr/Abl selektiv in malignen Zellen exprimiert wird und diese onkogene Tyrosinkinase kausal für die CML ist, stellt dieses Fusionsprotein einen hervorragenden Angriffspunkt für eine zielgerichtete Behandlung der Krankheit dar. Seit der Einführung im Jahr 2001 hat sich der Bcr/Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib Mesylat (Glivec®; GleevecTM; STI571) zum Goldstandard in der Primärtherapie der CML etabliert. Obwohl bisher große therapeutische Erfolge mit Imatinib bei Patienten mit CML in chronischer Phase erzielt werden konnten, ist nach aktuellem Erkenntnisstand keine Eliminierung aller leukämischen Zellen durch eine Imatinib-Monotherapie in Patienten möglich. Die Entwicklung neuer Behandlungs-Strategien, die eine vollständige Heilung der CML erzielt, ist nach wie vor von großer Bedeutung. Erfolgversprechend könnte die Kombination aus Imatinib und anderen Medikamenten, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, sein. In der vorliegenden Dissertation gelang erstmalig der Nachweis, dass eine Behandlung mit Imatinib zu einer Hypersensitivität gegenüber Cisplatin führt sowohl bei murinen Bcr/Abl positiven Zellen als auch in primären Philadelphia- positiven Progenitor-Zellen aus CML Patienten, die in diesem Ausmaß bisher nicht beschrieben wurde. Die Kombination aus Imatinib und Cisplatin führte bei Bcr/Abl-positiven Zellen zu einer extrem verstärken Induktion von Zelltod, während dieselbe Behandlung keine zusätzlichen Effekte bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte der durch eine Imatinib/Cisplatin- Behandlung vermittelte Viabilitätsverlust durch eine zusätzliche Inkubation mit dem Mdm2-Antagonisten Nutlin weiter verstärkt werden, sodass im Zellliniensystem ein fast 100 %-iger Zelltod und bei primären Zellen eine fast komplette Hemmung der Koloniebildung erreicht wurde. Interessanterweise ergab ein Vergleich der Cisplatin-Sensitivität der Bcr/Abl-positiven Zelllinie BaF3p185 in Anwesenheit von Imatinib mit der von anderen Tumorzelllinien, dass durch Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen eine Sensitivität erreicht wurde, die vergleichbar mit der extrem sensitiven Hodenzelllinie N-TERA war. Zur Charakterisierung möglicher Ursachen dieser Hypersensitivität Imatinib- behandelter CML Zellen gegenüber Cisplatin, wurden zunächst mögliche Alterationen der Regulation des Zellzyklusarrests nach Cisplatin-Behandlung untersucht. Cisplatin induzierte sowohl bei Bcr/Abl-positiven als auch bei Bcr/Abl-negativen Zellen einen G2/M-Arrest. Durch die Behandlung mit Imatinib kam es zu einem Verlust des G2/M-Arrests und zu einer schnellen Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen, während dieselbe Behandlung keinen Effekt auf den Cisplatin-induzierten G2/M-Arrest bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte mittels einer Analyse der einzelnen Zellgenerationen 24 h nach Cisplatin-Behandlung gezeigt werden, dass Bcr/Abl-positive Zellen bereits nach der ersten Zellteilung in der G2/MPhase arretierten und eine kleine Zellpopulation, vermutlich nach erfolgter Reparatur des DNASchadens, ohne signifikanten Verlust der mitochondrialen Integrität, eine dritte Zellteilung vollendet hatte. In Anwesenheit von Imatinib hingegen waren die Zellen nicht in der Lage in G2/M zu arretieren. Vielmehr kam es bereits nach der ersten Zellteilung zum Verlust der mitochondrialen Integrität infolge von Cisplatin. Es ist bekannt, dass es durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zur Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium und damit zu einem Caspase-abhängigen Todesmechanismus kommt. Interessanterweise verlief der Imatinib/Cisplatin-induzierte Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen unabhängig von Caspasen. Neben Cytochrom C wird auch AIF aus dem Mitochondrium freigesetzt, das in der Lage ist einen Caspase-unabhängigen Todesmechanismus zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es in Bcr/Abl-positiven Zellen infolge einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer AIFTranslokation in den Zellkern und somit zur Induktion von Zelltod kam. Als mögliche Ursache für den Verlust des G2/M-Arrests konnte eine verminderte ATMAktivierung infolge einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung selektiv bei Bcr/Abl-positiven Zellen identifiziert werden. Die verminderte Aktivierung von ATM führte zu einer Reduktion der p53-Phosphorylierung an Serin 15 und zu einer leichten Reduktion der p53-Induktion nach Cisplatin-Behandlung. Die verminderte p53-Phosphorylierung an Serin 15 hatte Konsequenzen auf die durch zellulären Stress hervorgerufene p53-Antwort, wobei es zu einer verminderten transkriptionellen Aktivität von p53 kam. Dies konnte durch die reduzierte Expression der p53-Zielstukturen, Mdm2 und p21, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene, gezeigt werden. Im Gegensatz zu Mdm2 und p21 waren die proapoptotischen p53-abhängigen Gene wie BAX, PUMA und NOXA bereits in Abwesenheit von zellulärem Stress hoch exprimiert und wurden durch eine Behandlung mit Cisplatin nicht weiter induziert. Auch eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit Imatinib hatte keine Auswirkungen auf die Expression von BAX, PUMA und NOXA. Demnach hat p53 auch keine transaktivierende Wirkung auf diese proapoptotischen Gene in diesem Zellsystem nach einer Behandlung mit Cisplatin. Dies bedeutet, dass die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor durch eine Behandlung mit Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen gestört war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte dennoch gezeigt werden, dass p53 für den hypersensitiven Phänotyp, der bei Bcr/Abl-positiven Zellen durch eine Imatinib/Cisplatin-Behandlung induziert wird, eine entscheidende Rolle spielt. p53 hat neben seiner Funktion als Transkriptionsfaktor im Zellkern auch im Zytoplasma eine wichtige Zelltod-induzierende Funktion. Im Zytoplasma ist p53 in der Lage durch die Bindung an pro- und antiapoptotische Proteine, unabhängig von seiner transkriptionellen Aktivität, BAX zu aktivieren und somit Zelltod zu induzieren. Voraussetzung für die Ausübung dieser Funktion ist eine Lokalisation von p53 im Zytoplasma. In dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass p53 nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung Bcr/Abl-positiver Zellen größtenteils im Zytoplasma akkumuliert. Der p53-Export aus dem Zellkern wird vermittelt durch eine verminderte p53-Phosphorylierung am Serin-Rest an Stelle 15, durch eine niedrige Mdm2-Proteinmenge und durch die Aktivierung von FoxO3a. Alle drei Mechanismen konnten in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Demnach wird die rasche Induktion von Zelltod durch zytoplasmatisches p53 vermittelt. Im Zytoplasma interagiert p53 mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-xL, wodurch eine Aktivierung von BAX durch p53 und somit die Induktion von Zelltod verhindert wird. Es konnte gezeigt werden, dass es selektiv bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer signifikanten Reduktion der Bcl-xL-Expression kam. Diese verminderte Expression von Bcl-xL führte wahrscheinlich zu einem Ungleichgewicht zwischen Bcl-xL und p53 zugunsten von p53, sodass vermehrt “freies“ p53 im Zytoplasma vorlag, das dann in der Lage war, BAX zu aktivieren und einen mitochondrialen Zelltod zu induzieren. Die entscheidende Rolle der verminderten Bcl-xL Expression für den hypersensitiven Phänotyp konnte dadurch belegt werden, dass eine exogene Expression von Bcl-xL, die das Gleichgewicht mit p53 wiederherstellte, ausreichend war, um den Verlust der mitochondrialen Membranintegrität und die Translokation von AIF zu verhindern. Die Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung konnte dadurch signifikant reduziert werden. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass für die Induktion einer Tumorselektiven Hypersensitivität gegenüber Cisplatin zwei Signalwege von entscheidender Bedeutung sind. Durch die Hemmung des ATM/p53-Signalwegs sind Bcr/Abl-positive Zellen nicht mehr in der Lage, in der G2/M-Phase zu arretieren. Darüber hinaus vermittelt eine Cisplatin-Behandlung in Anwesenheit von Imatinib die Akkumulation von p53 im Zytoplasma und eine gleichzeitige Reduktion der Bcl-xL-Expression, was zu einer massiven Induktion von Zelltod führt. Die Befunde dieser Arbeit könnten auch für andere maligne Erkrankungen bedeutend sein. Aufgrund der Tatsache, dass bei vielen Tumoren Signalwege der DNA-Schadensprozessierung per se dereguliert sind, könnte die pharmakologische Hemmung eines weiteren Wegs zu einer vergleichbaren Hypersensitivität führen, wie sie in vorliegender Dissertation nach Hemmung der ATM/p53-Achse und der Bcl-xL-Expression beobachtet wurde. Da bei normalen Zellen durch diesen pharmakologischen Eingriff lediglich ein Weg gehemmt würde, der andere jedoch weiterhin intakt wäre, wäre diese Hypersensitivität tumorselektiv.Item Open Access Targeted lipid coated nanoparticles : delivery of tumor necrosis factor functionalized particles to tumor cells(2009) Messerschmidt, Sylvia; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)Polymeric nanoparticles become more and more important as versatile carrier systems for therapeutic and diagnostic compounds embedded within the particle matrix or attached to the particle surface through physical or covalent bonds. Nanoparticle displaying tumor necrosis factor (TNF) on their surface, efficiently activate both TNF receptors and thus mimic the bioactivity of membrane-bound TNF. This leads to a strikingly increased apoptosis. However, an in vivo application for cancer therapy is hampered by the potential systemic action of TNF, which can lead to severe side effects and even death. In this study, targeted lipid-coated TNF-functionalized nanoparticles (scTNF-TLP) were generated, which may be a promising formulation of TNF enabling a systemic and tumor selective application. ScTNF-TLP are composed of an inner polymeric core with a surface that is functionalized with a single-chain TNF derivative (scTNF). The particles are surrounded by a sterically stabilized polyethylene glycol (PEG)-lipid coat. Thus a strong reduction of the cytotoxic effect could be achieved which indicates an effective shielding of the TNF activity. By insertion of a single-chain Fv fragment (scFv) directed against the tumor stroma marker fibroblast activation protein (FAP) an active targeting could be demonstrated. The insertion of the targeting moiety into the lipid coat was achieved by a defined and site-directed coupling through a genetically engineered cysteine residue. In order to improve the scFv format for coupling a comparative analysis of various newly designed variants was performed. The most suitable variants contain the hexahistidyl-tag for purification and detection incorporated into the linker sequence together with a cysteine residue (LCH). The resulting TLP and scTNF-TLP bound specifically to FAP-expressing cells but not to FAP-negative cells. The lipid-coating strongly reduced the unspecific uptake of particles and also the scTNF-P mediated apoptosis. In contrast, an increased cytotoxicity towards FAP-expressing cells could be shown for anti-FAP scTNF-TLP compared to lipid-coated scTNF-P without targeting molecule. This indicates a selective delivery of the embedded TNF-functionalized nanoparticle to antigen-positive target cells. In summary, by encapsulation into a multifunctional lipid-shell, polymeric and TNF-functionalized nanoparticles, which are subject to an unspecific activity towards a variety of cells and tissue, could be converted in a targeted lipid-coated nanoparticulare carrier system and demonstrated a target cell-specific action of the bioactive compound. This system benefits from a large modularity: beyond the bioactive compound also the targeting moiety as well as the inner core could be adapted at the current requirements. Thus, a manifold application as imaging or drug carrier system is conceivable. Moreover, a combination of both approaches enables usage for a diagnostic as well as therapeutic application.Item Open Access Characterising heterogeneous TRAIL responsiveness and overcoming TRAIL resistance in multicellular tumour spheroids(2018) Stöhr, Daniela; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Item Open Access Predicting response to immunotherapy in metastatic melanoma by a personalized mathematical model(2020) Tsur, Neta; Morrison, Markus (Prof. Dr.)At present, immune checkpoint inhibitors, such as pembrolizumab, are widely used for the treatment of advanced non resectable melanoma, as they induce more durable responses than other available treatments. However, the overall response rate does not exceed 50%, and prediction of the individual benefit of patients from these therapeutics remains an unmet clinical need. Mathematical models that predict the response of patients with advanced melanoma to immune checkpoint inhibitors can contribute to better informed clinical decisions. The aim of this work was to develop a new personalization algorithm for predicting time to disease progression under pembrolizumab treatment, based on personal mathematical models of patients with advanced melanoma. First, a simple mathematical model was developed for describing the interactions of an advanced melanoma tumor with both the patient’s immune system and the immunotherapeutic drug, pembrolizumab. The local and global dynamics of the treatment-free model was analyzed analytically and numerically. The complete model was then implemented in conjunction with clinical pre-treatment data, in an algorithm which enables prediction of the personal response to the drug. To develop the algorithm, clinical data of 54 patients with advanced melanoma under pembrolizumab were collected retrospectively. In the following, clinical parameters before checkpoint inhibition and in the early course of pembrolizumab treatment were correlated to the mathematical model parameters. Using the algorithm together with the longitudinal tumor burden of each patient, the personal mathematical models were identified and used in simulations to predict the patient’s time to progression. The prediction capacity of the algorithm was validated by the Leave-One-Out cross validation methodology. The results show that zero, one, or two steady states of the treatment-free mathematical model exist in the phase plane, depending on the parameter values of individual patients. Without treatment, the simulated tumors grew uncontrollably. At increased efficacy of the immune system, i.e. due to immunotherapy, two steady states were found, one leading to uncontrollable tumor growth, whereas the other resulted in tumor size stabilization. The model analysis indicates that a sufficient increase in the activation of CD8+ T cells results in stable disease, whereas a significant reduction in T-cell exhaustion, which indirectly promotes CD8+ T cell activity, entails a temporal reduction in the tumor mass, but fails to control disease progression in the long run. Importantly, the initial tumor burden influences the in-treatment dynamics: small tumors responded better to treatment than larger tumors. Among the analyzed clinical parameters, the baseline tumor load, the Breslow tumor thickness, and the status of nodular melanoma were significantly correlated with the activation and exhaustion rates of CD8+ T cells. Using the measurements of these correlates to personalize the mathematical model, the time to progression of individual patients was predicted (Cohen’s κ = 0.489). Comparison of the predicted and clinical time to progression in patients progressing during the follow-up period showed moderate accuracy (R2=0.505). The treatment-free model analysis suggests that disease progression and response to immune checkpoint inhibitors depend on the ratio between activation and exhaustion rates of CD8+ T cells as well as the tumor growth rate. This analysis provides a foundation for the use of computational methods to personalize immunotherapy. Furthermore, the results suggest that a relatively simple mathematical mechanistic model, implemented in a computational algorithm, can be personalized by baseline clinical data before immunotherapy onset. The algorithm, currently yielding moderately accurate predictions of individual patients’ response to pembrolizumab, can be improved by using a larger number of patient files. Validation of the algorithm by an independent clinical dataset will enable its use as a tool for treatment personalization.Item Open Access Characterization of persister-cell derived ovarian cancer cells and methods for advanced 3D cell and tissue culture(2021) Böpple, Kathrin; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)Item Open Access IL-15-based trifunctional antibody-fusion proteins with costimulatory TNF-superfamily ligands for cancer immunotherapy(2018) Beha, Nadine; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)IL-15 shows great potential to support an antitumor immune response and emerges as a promising agent in cancer immunotherapy. However, the systemic application of IL-15 is associated with toxicity and, as a monotherapy the efficacy of IL-15 is still limited. This study focusses on the development of novel trifunctional fusion proteins enforcing the activity of IL-15 with costimulatory ligands of the TNF superfamily and targeting the therapeutic activity to the tumor site by an antibody moiety. The homotrimeric trifunctional fusion proteins of the first generation was comprised of an antibody moiety (scFv), IL-15 fused to the extended sushi domain of the IL-15Rα chain (RD), and the extracellular domain (ECD) of 4-1BBL. Non-covalent trimerization of the ECD of 4-1BBL led to a homotrimeric fusion protein with three antibody moieties and three RD_IL-15 units. Based on the first generation trifunctional fusion protein, a novel second generation trifunctional fusion protein incorporating the ligand of the TNF superfamily in the single-chain format, i.e. genetic fusion of three extracellular domains by linkers on the same polypeptide chain, was generated, resulting in a monomeric trifunctional fusion protein with only one functional unit of each component. Similar T cell stimulation in a non-targeted setting, even improved capacity to enhance T cell stimulation when target bound and a clear antitumor effect in a mouse model in vivo was observed for the novel trifunctional fusion protein in the single-chain format. Furthermore, OX40L and GITRL were successfully incorporated into the novel trifunctional fusion protein in the single-chain format demonstrating stable protein configuration. Advantageous costimulatory properties in comparison to the combination of the respective bifunctional fusion proteins were observed for all trifunctional fusion proteins. Strongest synergistic effects were shown for RD_IL-15_scFvFAP_scGITRL in terms of enhancing the cytotoxic potential of CD8+ T cells and enhanced proliferation of CD4+ T cells. Finally, in a syngeneic lung tumor mouse model evaluating the antitumor potential of RD_IL-15_scFvFAP_scGITRL revealed a strong, targeting-dependent antitumor response. Additionally, the effect of an EGFR-directed trifunctional fusion protein on Trastuzumab-mediated ADCC was evaluated. Strong enhancement of the ADCC was achieved by the trifunctional fusion protein RD_IL-15_scFvEGFR_sc4-1BBL and the bifunctional fusion protein RD_IL-15_scFvEGFR. Thus, the trifunctional fusion protein format incorporating the ligand of the TNF superfamily in the single-chain format appears as a promising platform with versatile opportunities for further development.Item Open Access Die TRAIL-Suszeptibilität humaner Melanomzellen : Bedeutung des Tumorprogressionsstadiums und Modulation durch Immunsuppressiva(2009) Thayaparasingham, Bharathy; Kulms, Dagmar (PD Dr.)Die Tatsache, dass sich viele maligne Melanome resistent gegenüber dem tumorselektiven Liganden TRAIL (tumor necrosis-related apoptosis-inducing ligand) verhalten, erfordert erweiterte Ansätze in der Melanomtherapie. Durch die Untersuchungen, die mit 18 unterschiedlichen Melanomzelllinien durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass die TRAIL-Suszeptibilität unabhängig vom jeweiligen Tumorprogressionsstadium ist, und dass die Kostimulation mit einer sublethalen UVB-Dosis ubiquitär eine stark synergistisch sensibilisierende Auswirkung auf die TRAIL-resistenten Melanomzellen hat. Es zeigte sich hierbei, dass das TRAIL-Rezeptorexpressionsmuster (Agonisten versus Antagonisten) nicht ausschlaggebend für das Apoptoseverhalten der Melanomzellen ist. Vielmehr scheinen intrazelluläre Mechanismen für die unterschiedliche Suszeptibilität gegenüber TRAIL verantwortlich zu sein. Intrazelluläre Studien zeigten schließlich, dass die grundsätzliche TRAIL-Sensitivität durch Caspase-8-Spaltung und -Aktivität determiniert wird. Die UVB-induzierte Sensitivierung resistenter Zellen hingegen wird auf dem Niveau von Caspase-3 und XIAP entschieden. So geht die UVB-induzierte Sensitivierung mit einer verstärkten XIAP-Depletion und vollständiger Caspase-3-Prozessierung vom 21 kD Fragment in das katalytisch aktive 17 kD Fragment sowie dessen Aktivierung einher. Parallel zur XIAP-Depletion zeigte sich eine ebenfalls deutlich zunehmende Degradierung des NFkB-Inhibitors IkBa. Da NFkB ein Transkriptionsfaktor ist, der durch die Aufregulierung anti-apoptotischer Gene wie XIAP Apoptoseresistenz vermittelt, könnte so der TRAIL-induzierten Apoptose entgegengewirkt werden. Andererseits ist bekannt, dass NFkB in Anwesenheit von DNA-schädigenden Agenzien seine Eigenschaften an selektiven Promotoren ändert und so von einem Aktivator in einen Repressor dieser Gene konvertiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass eine NFkB-Freisetzung nach TRAIL und UVB-Kostimulation zu einer transkriptionellen Repression u.a. des XIAP-Gens führt und damit maßgeblich zu dessen zytosolischer Depletion und der Sensitivierung gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose beiträgt. Die Schlüsselrolle von XIAP in der Suszeptibilität von Melanomzellen gegenüber TRAIL konnte durch Überexpressions- und „knock down„- Versuche von XIAP eindeutig bestätigt werden. Durch Überexpression einer IkBa Superrepressorvariante konnte schließlich die Abhängigkeit der XIAP-Depletion und der Apoptose-Sensitivität von NFkB bestätigt werden. XIAP scheint also die entscheidende Rolle bei der Vermittlung der TRAIL-Resistenz in allen hier untersuchten Melanomzelllinien zu spielen. Die Entschlüsselung dieses ubiquitären, molekularen Sensitivierungsmechanismus durch Kombinationstherapie mit UVB zeigt neue Möglichkeiten wie die TRAIL-Resistenz im Melanomsystem durchbrochen werden kann und bietet somit die Basis für neue Therapieansätze zur erfolgreichen Bekämpfung des malignen Melanoms.Item Open Access Regulation of START domain containing proteins through membrane interaction(2009) Erlmann, Patrik; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)In mammals, there are 15 proteins that contain a lipid-binding START domain and those that have been characterized are able to transfer lipids between membranes in vitro. A prerequisite for START domains to act as lipid carriers is the interaction of the protein with cellular membranes. The goal of this thesis was to investigate how membrane targeting of these START domaincontaining proteins is regulated and affects protein function. Three START family members were studied in greater detail: StarD10, CERT/StarD11 and DLC1/StarD12. StarD10 is a minimal START domain protein with no additional targeting sequences, which was previously shown to transfer phosphatidylcholine (PC) and to a lesser extent phosphatidylethanolamine (PE) in vitro. By mass spectrometry, we identified a novel phosphorylation site in StarD10 at serine 284. We were able to show that casein kinase II mediated phosphorylation of this site reduced lipid transfer in vitro and membrane binding in vivo. However, the intracellular route of lipid transfer by StarD10 still remains to be determined. By contrast, the ceramide transfer protein CERT is known to shuttle ceramide from the endoplasmatic reticulum (ER) to the Golgi complex. Targeting to these organelles is mediated via the FFAT motif that binds to the ER-resident protein VAP and the PH domain that binds phosphatidylinositol-(4)-phosphate (PI(4)P) enriched in Golgi membranes. Here we identified CERT as a novel substrate for Protein Kinase D (PKD) at the Golgi. PKD-mediated phosphorylation at serine 132 is shown to reduce the PH domain-dependent interaction of CERT with PI(4)P-containing membranes and ceramide transfer. Thus, membrane binding of both StarD10 and CERT is negatively regulated by phosphorylation and this results in decreased lipid transfer efficiency. The tumor suppressor protein DLC1 (Deleted in Liver Cancer 1) is a Rho GTPase activating protein (GAP), which contains a START domain of unknown specificity and function. Through its GAP domain DLC1 inactivates the small GTPase RhoA to control actin cytoskeletal remodeling and biological processes such as cell migration and proliferation. In this thesis, DLC1 was found to interact with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) through a previously unrecognized polybasic region (PBR). Interestingly, PI(4,5)P2-containing membranes enhanced DLC1 RhoGAP activity in vitro. In living cells, a DLC1 mutant lacking an intact PBR inactivated Rho signaling less efficiently and was severely compromised in suppressing cell spreading, directed migration and proliferation. PI(4,5)P2 thus appears to be an important cofactor in DLC1 regulation in vivo. The PBR, however, was not sufficient to recruit DLC1 to membranes and its deletion did not alter DLC1 subcellular localization. Instead, we provide evidence for alternative mechanisms towards the regulation of DLC1 localization. DLC1 interaction with the lipid phosphatase PTEN may contribute to plasma membrane localization, while interaction with 14-3-3 adaptor proteins sequesters the protein in the cytoplasm.Item Open Access Modeling time delay in the NFκB signaling pathway following low dose IL-1 stimulation(2011) Witt, Johannes; Barisic, Sandra; Sawodny, Oliver; Ederer, Michael; Kulms, Dagmar; Sauter, ThomasStimulation of human epithelial cells with IL-1 (10 ng/ml) + UVB radiation results in sustained NFκB activation caused by continuous IKKbeta phosphorylation. We have recently published a strictly reduced ordinary differential equation model elucidating the involved mechanisms. Here, we compare model extensions for low IL-1 doses (0.5 ng/ml), where delayed IKKbeta phosphorylation is observed. The extended model including a positive regulatory element, most likely auto-ubiquitination of TRAF6, reproduces the observed experimental data most convincingly. The extension is shown to be consistent with the original model and contains very sensitive processes which may serve as potential intervention targets.Item Open Access Inhibition des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs zur Überwindung der Therapieresistenz beim malignen Melanom(2013) Niessner, Heike; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Das Melanom gehört zu den malignen Tumoren des Menschen, die im Verlauf der Erkrankung mit hoher Wahrscheinlichkeit Gehirnmetastasen ausbilden, die zum Tod des Patienten führen. In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil dargelegt, dass die Inhibition des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber Chemotherapie erhöht. Der PI3K Inhibitor LY294002 und der mTOR Inhibitor Rapamycin kombiniert mit Cisplatin oder Temozolomid supprimierten das antiapoptotische Bcl-2 Familienprotein Mcl-1 und induzierten effizient Apoptose in Melanomzellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass der FTI Lonafarnib in Melanomzellen den mTOR-Signalweg inhibiert und die proapoptotischen Effekte von Sorafenib in Melanomzellen verstärkt. Die Apoptoseinduktion durch Lonafarnib und Sorafenib ging mit einer Herunterregulation des Bcl-2 Familienproteins Mcl-1 einher. Darüber hinaus regulierten Lonafarnib und Sorafenib die ER-Stress Gene p8 und CHOP hoch und induzierten ER-Stress vermittelte Apoptose. Im dritten Teil der Arbeit wurde dargelegt, dass die Hyperaktivierung des AKT-Überlebenssignalwegs in Melanomhirnmetastasen durch Mikromilieu-spezifische Faktoren, die von Astrozyten sezerniert werden, hervorgerufen wird. Die Inhibition des aktivierten PI3K-AKT-Signalwegs hemmte hocheffizient das Wachstum von Hirnmetastasen im Mausmodell. Die in den drei Teilprojekten erarbeiteten Daten sprechen dafür, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Therapieresistenz des Melanoms spielt und dass die effiziente Inhibition dieses Signalwegs eine vielversprechende Strategie zur Überwindung der Therapieresistenz des Melanoms darstellt.