04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Einfluss DNA-bindender Proteine auf die Hybridisierungsdynamik diagnostischer DNA-Mikroarrays(2002) Schulz, GunnarIn der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Hybridisierungsdauer bei DNAMikroarrayexperimenten durch einen biochemischen Ansatz zu verringern. Dabei wurden Arrays mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern zur SNP-Detektion im β-Lactamasegen verwendet. Durch den Zusatz des Tumorsupressorproteins p53 sollte die Hybridisierung komplementärer Sonde und Probe beschleunigt werden. Von diesem Protein ist u.a bekannt, daß es einen Effekt auf die Hybridisierungskinetik von DNA-Einzelstränge in vivo und in vitro besitzt. Zur Kontrolle und Optimierung dieser p53-Aktivität wurden Hybridisierungsversuche mit fluoreszenzmarkiertem PCR-Produkt und einzelsträngigen Oligonukleotide durchgeführt. Der Nachweis von DNA-Einzel- bzw. Doppelsträngen erfolgte über deren unterschiedliches Laufverhalten in Acrylamidgelen (Band shift assay). Die Hybridisierungskinetik beider Ansätze konnte durch den Einsatz von p53 beschleunigt werden. Die in den Band shift Experimenten ermittelten Reaktionsbedingungen wurden nachfolgend auf Mikroarray-Versuche übertragen. Auch für dieses heterogene System mit festphasengebundener Sonden-DNA konnte eine Verkürzung der Hybridisierungsdauer mit p53 gezeigt werden. Bereits nach 30-minütiger Inkubation wurden deutliche Hybridisierungssignale nachgewiesen. Gegenüber Hybridisierungsversuchen mit reinem Puffer, ist dies ein deutlicher Zeitgewinn. Um den Bedarf an p53 nachfolgender Arrayexperimente decken zu können, wurden initiale Klonierungs- und Expressionsversuche in E.coli durchgeführt.