04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access TRAIL-based multivalent and multifunctional fusion proteins and liposomes for therapeutic applications(2014) Seifert, Oliver; Kontermann, Roland (Prof. Dr.)Der aktuelle Stand der klinischen Forschung bietet im Bereich der pro-apoptotischen Rezeptoragonisten, welche die TRAIL-Rezeptoren (TNF-related apoptosis-inducing ligand) ansteuern, für die Krebstherapie bisher keine zufriedenstellenden Ergebnisse. In dieser Doktorarbeit wurde ein therapeutisches Konzept entwickelt, das auf der zielgerichteten und multivalenten Präsentation von ebendiesem TRAIL basiert, und welches eine effektive Induktion des Zelltods in Krebszellen durch die Aktivierung der beiden Todesrezeptoren DR4 und DR5 vorsieht, indem die membrangebundene Form des TRAIL-Moleküls nachgeahmt wird. Folgende zielgerichtete und multivalente TRAIL-Moleküle wurden hergestellt: a) als Dimer angeordnete, zielgerichtete TRAIL-Fusionsproteine durch Verwendung des Homodimerisierungs-Moduls EHD2 (Domäne 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgE), b) zielgerichtete und mit TRAIL-Molekülen modifizierte Liposomen. Darüber hinaus wurde MHD2 (Domäne 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgM) als ein weiteres Homodimerisierungs-Modul genauer untersucht und als Dimer-angeordnete, zielgerichtete und multivalente TNF (Tumor Nekrose Faktor)-Fusionsproteine hergestellt. Durch Fusionierung eines einzelkettigen Antikörper-Fragments (scFv), welches entweder gegen EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR1) oder gegen HER2 (EGFR2) gerichtet ist, an den N- und/oder C-Terminus des MHD2 konnten mono- oder bi-spezifische Antikörper-MHD2-Fusionsproteine hergestellt werden. Diese wiesen einen Aviditätseffekt und eine kooperative Bindung gegenüber Tumorzellen auf. Indem man das MHD2 mit einem einzelkettigen Derivat des TNF (scTNF) modifizierte, konnte ein hexavalentes TNF-Fusionsprotein generiert werden, welches die TNF-Rezeptoren 1 und 2 zu aktivieren vermag und demnach das membrangebundene TNF-Molekül nachahmen kann. Darüber hinaus, wurde durch den scFv-vermittelten Transport des zielgerichteten und multivalenten TNF-Fusionsproteins zu EGFR-positiven Zellen seine Aktivität der TNF-Rezeptor-Aktivierung weiter gesteigert. Durch Fusionierung eines gegen EGFR gerichteten scFv-Fragments an den N-Terminus des EHD2 und eines einzelkettigen Derivats des TRAIL-Moleküls (scTRAIL) an den C-Terminus, konnte ein zielgerichtetes Fusionsprotein hergestellt werden, welches multivalente TRAIL- und scFv-Moleküle präsentiert (scFv-EHD2-scTRAIL). In vitro zeigte sich eine ausgeprägte tumorzellspezifische Induktion des Zelltods für die TRAIL-Fusionsproteine im Vergleich zu den trivalenten scTRAIL-Molekülen: Das scFv-EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein wies sogar eine 8- bis 18-mal stärkere Apoptoseinduktion als das nicht-zielgerichtete EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein auf. Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in einer ausgezeichneten antitumoralen Aktivität im xenografen Colo205 Tumormodell bei Mäusen wieder. Alternativ wurden Liposomen mit TRAIL-Molekülen modifiziert, um diese multivalent präsentieren zu können (LipoTRAIL, LT). Außerdem wurden die TRAIL-funktionalisierten Liposomen mit an EGFR bindenden scFv-Fragmenten ausgestattet (Immuno-LipoTRAIL, ILT), um einen zielgerichteten Transport zu EGFR-positiven Zellen zu ermöglichen. Sie banden spezifisch an EGFR-positive Zellen und induzierten so einen wirksameren Zelltod verglichen mit den LTs. Diese funktionalisierten Liposomen wiesen im Vergleich zum löslichen TRAIL-Molekül eine verlängerte Serumhalbwertszeit auf. Darüber hinaus konnte eine ausgeprägte antitumorale Aktivität der ILT im xenografen Colo205 Tumormodel bei Mäusen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass durch den Einsatz von Fusionsproteinen und funktionalisierten Liposomen, die durch multivalente TRAIL-Moleküle und scFv-Fragmente modifiziert wurden, die Einschränkung der PARA, welche derzeit in klinischen Studien erprobt werden, überwindet werden könnte.