04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Durchflusszytometrische Bestimmung der Farbstoffausbreitung über Gap-Junction-Kanäle(1999) Schulz, GunnarGap-Junction-Kanäle verbinden benachbarte Vertebraten-Zellen und ermöglichen den interzellulären Transfer von geladenen und ungeladenen Molekülen bis zu einem Molekulargewicht von 1 kd. Die Existenz funktioneller Gap-Junction-Kanäle kann mit Fluoreszenzfarbstoffen untersucht werden Dabei wird der Farbstoff durch eine Glasmikroelektrode in eine Zelle injiziert und die Kopplung durch Auszählen der gefärbten Zellen im Mikroskop bestimmt. Eine genauere Methode zur Quantifizierung der Zell-Zell Kopplung ist die Farbstoff-Beladungs-Technik mit Calcein AM. In dieser Arbeit wurde die Farbstoff-Beladungstechnik mit der Fluoreszenz aktivierten Durchflusszytometrie gekoppelt. Durch die große Anzahl der untersuchten Zellen eines Ansatzes ermöglicht diese Methode eine verbesserte Auflösung gegenüber der Injektions-methode. Es wurden die Kopplungsraten verschiedener Ansätze mit 6 Zell-Linien untersucht.Item Open Access Einfluss DNA-bindender Proteine auf die Hybridisierungsdynamik diagnostischer DNA-Mikroarrays(2002) Schulz, GunnarIn der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Hybridisierungsdauer bei DNAMikroarrayexperimenten durch einen biochemischen Ansatz zu verringern. Dabei wurden Arrays mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern zur SNP-Detektion im β-Lactamasegen verwendet. Durch den Zusatz des Tumorsupressorproteins p53 sollte die Hybridisierung komplementärer Sonde und Probe beschleunigt werden. Von diesem Protein ist u.a bekannt, daß es einen Effekt auf die Hybridisierungskinetik von DNA-Einzelstränge in vivo und in vitro besitzt. Zur Kontrolle und Optimierung dieser p53-Aktivität wurden Hybridisierungsversuche mit fluoreszenzmarkiertem PCR-Produkt und einzelsträngigen Oligonukleotide durchgeführt. Der Nachweis von DNA-Einzel- bzw. Doppelsträngen erfolgte über deren unterschiedliches Laufverhalten in Acrylamidgelen (Band shift assay). Die Hybridisierungskinetik beider Ansätze konnte durch den Einsatz von p53 beschleunigt werden. Die in den Band shift Experimenten ermittelten Reaktionsbedingungen wurden nachfolgend auf Mikroarray-Versuche übertragen. Auch für dieses heterogene System mit festphasengebundener Sonden-DNA konnte eine Verkürzung der Hybridisierungsdauer mit p53 gezeigt werden. Bereits nach 30-minütiger Inkubation wurden deutliche Hybridisierungssignale nachgewiesen. Gegenüber Hybridisierungsversuchen mit reinem Puffer, ist dies ein deutlicher Zeitgewinn. Um den Bedarf an p53 nachfolgender Arrayexperimente decken zu können, wurden initiale Klonierungs- und Expressionsversuche in E.coli durchgeführt.