04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
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Item Open Access Precision 3D‐printed cell scaffolds mimicking native tissue composition and mechanics(2020) Erben, Amelie; Hörning, Marcel; Hartmann, Bastian; Becke, Tanja; Eisler, Stephan A.; Southan, Alexander; Cranz, Séverine; Hayden, Oliver; Kneidinger, Nikolaus; Königshoff, Melanie; Lindner, Michael; Tovar, Günter E. M.; Burgstaller, Gerald; Clausen‐Schaumann, Hauke; Sudhop, Stefanie; Heymann, MichaelCellular dynamics are modeled by the 3D architecture and mechanics of the extracellular matrix (ECM) and vice versa. These bidirectional cell‐ECM interactions are the basis for all vital tissues, many of which have been investigated in 2D environments over the last decades. Experimental approaches to mimic in vivo cell niches in 3D with the highest biological conformity and resolution can enable new insights into these cell‐ECM interactions including proliferation, differentiation, migration, and invasion assays. Here, two‐photon stereolithography is adopted to print up to mm‐sized high‐precision 3D cell scaffolds at micrometer resolution with defined mechanical properties from protein‐based resins, such as bovine serum albumin or gelatin methacryloyl. By modifying the manufacturing process including two‐pass printing or post‐print crosslinking, high precision scaffolds with varying Young's moduli ranging from 7‐300 kPa are printed and quantified through atomic force microscopy. The impact of varying scaffold topographies on the dynamics of colonizing cells is observed using mouse myoblast cells and a 3D‐lung microtissue replica colonized with primary human lung fibroblast. This approach will allow for a systematic investigation of single‐cell and tissue dynamics in response to defined mechanical and bio‐molecular cues and is ultimately scalable to full organs.Item Open Access Construction of robust Escherichia coli strains for large-scale production(2022) Ziegler, Martin; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)The biotechnical production of many fine chemicals, proteins or pharmaceuticals depends on large-scale microbial cultivations. Due to limited mixing, heterogeneities in process relevant parameters such as nutrient concentrations arise in such fermentations. Escherichia coli (E. coli) is a model organism frequently used in the biotechnological industry. If E. coli is cultivated under heterogeneous conditions, biological reactions of the microorganism result in reduced process performance. Since large-scale fermentations are not economically feasible in academic settings, scale-down reactors that mimic aforementioned heterogeneities are used to investigate heterogenous fermentations. Previous studies in scale-down reactors unraveled that, depending on the process strategy, the unstable supply of a limiting primary carbon or nitrogen source such as glucose or ammonium is one of the underlying causes of process performance loss. Low concentrations of glucose or ammonium elicit the stringent response as a biological starvation reaction which comprises extensive transcriptional reactions. In the first project that contributes to this thesis, the regulatory and transcriptional reactions of the strains E. coli MG1655 and E. coli SR to repeated exposure to ammonium starvation zones were examined in a scale-down reactor. The scale-down reactor followed a two-compartment approach and consisted of a stirred tank reactor and a plug-flow reactor simulating passage through a starvation zone. E. coli SR is a strain with modulated stringent response. It was observed that short-term starvation stimuli do not trigger this regulatory program in E. coli SR and the transcriptional reaction was noticeably reduced. Long-term adaptation of the strain to repeated cycles of limitation and starvation also clearly differed from E. coli MG1655. Despite lack of the stringent response, E. coli SR showed no deficits in the assimilation of the limiting ammonium or in biomass yield on ammonium. In the second project of this thesis, a series of deletion strains with robust phenotype against glucose starvation zones were constructed. Candidate genes were identified and successively removed from the genome of E. coli MG1655 by Recombineering. The fundamental growth parameters of the strains were determined in shaking flask fermentations and no noticeable differences compared to E. coli MG1655 were found. Chemostat cultivations in a scale-down reactor with glucose as the limiting nutrient source revealed that the final strain of the deletion series, E. coli RM214, had a significantly lower maintenance coefficient under heterogeneous conditions than E. coli MG1655. Moreover, in an exemplary heterologous protein productionscenario E. coli RM214 rhaB- pJOE4056.2_tetA proved to be more robust to heterogeneities and showed a significantly higher product yield than E. coli MG1655 rhaB- pJOE4056.2_tetA. In the third project of this thesis, the production of pyruvate in E. coli MG1655 by inhibition of pyruvate dehydrogenase through CRISPR interference was investigated. A central goal was to achieve the stable production in nitrogen-limited conditions. For this, different target sequences in the operon pdhR-aceEF-lpd were tested and the strains cultivated in shaking flask fermentations. All tested target sequences were generally suitable to trigger the accumulation of pyruvate. Combined CRISPR interference against two target sequences did not lead to an increased pyruvate yield in most cases. In addition, the strains E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 and E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 were characterized in two phase fermentations in lab-scale reactors. The initial phase was an unlimited exponential growth phase and was followed by an ammonium-limited production phase. E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 only produced pyruvate during the exponential phase, and reuptake of pyruvate occurred in the second phase. In contrast, E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 stably produced pyruvate during the exponential and the ammonium-limited phase and is a potential chassis strain for the growth-decoupled production of pyruvate derived bioproducts. The overarching research issues of the projects were the characterization of strains in heterogeneous conditions and the development of new strategies to improve their performance. The collected data leads me to conclude that the construction of robust microbial strains for large-scale applications is both expedient and feasible. Tailored genetic modifications are the method of choice to achieve this goal. Furthermore, suitable genetic constructs offer promising possibilities for the stable growth-decoupled production of chemicals in nitrogen-limited conditions.Item Open Access Funktionen eines regionalen naturwissenschaftlichen Vereins(1994) Kull, UlrichDie Gesellschaft für Naturkunde in Württemberg blickt auf 150 Jahre zurück; sie wurde gegründet im Herbst 1844. Seit ihrer Gründung dient sie der Erforschung der heimischen Natur und der Verknüpfung der Ergebnisse mit den allgemeinen Fortschritten der Naturwissenschaften. Sie arbeitet vor allem im Bereich der Bio- und Geowissenschaften.Item Open Access Lokalisation, Speicherung und Synthese von Polyphosphat in Agrobacterium tumefaciens C58(2021) Hellenbroich, Celina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr. rer. nat.)Polyphosphat (PolyP) besitzt eine ubiquitäre Verbreitung und erfüllt, je nach Organismus, unterschiedliche und extrem vielfältige Aufgaben. In Prokaryonten liegt PolyP in sogenannten Granula vor, während in einzelligen Eukaryonten, eine Membran das PolyP von dem Cytoplasma abtrennt. Vorangegangene Arbeiten weisen darauf hin, dass sogenannte Acidocalcisomen, eben jene membranumschlossene PolyP-Speicher aus Eukaryonten, auch in dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens vorhanden sein könnten. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass sich in A. tumefaciens, wie in Bakterien übliche, PolyP-Granula befinden, die nicht von einer Membran umschlossen sind. Im weiteren Verlauf wurde die Synthese von PolyP sowie die Lokalisation der Polyphosphatkinasen (PPKs) und anderer aus der Literatur bekannter, PolyP-assoziierter Proteine untersucht. Die PPK1At stellte sich hierbei als PolyP-Syntheseenzym heraus. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der PPKs in vitro, bei der für die PPK2At, neben der Bildung von NDP und NTP, eine oligophosphorylierende Funktion bis hin zu nonaphosphorylierten Nukleosiden entdeckt wurde. Außerdem stellte sich heraus, dass das PolyP-Granulum während des Zellzyklus wanderte und vielleicht durch die PPK1At mit der DNA assoziiert sein könnte. Aufgrund dieser Erkenntnisse konnte ein Modell des PolyP-Granulums und den in dieser Arbeit identifizierten, assoziierten Proteinen erstellt werden. Eine Deletion der ppk1 hatte zudem Auswirkungen auf die Zellmorphologie, die Infektionsrate von Pflanzenzellen und die Generationszeit von A. tumefaciens.Item Open Access Physical interactions strengthen chemical gelatin methacryloyl gels(2019) Rebers, Lisa; Granse, Tobias; Tovar, Günter E. M.; Southan, Alexander; Borchers, KirstenChemically cross-linkable gelatin methacryloyl (GM) derivatives are getting increasing attention regarding biomedical applications. Thus, thorough investigations are needed to achieve full understanding and control of the physico-chemical behavior of these promising biomaterials. We previously introduced gelatin methacryloyl acetyl (GMA) derivatives, which can be used to control physical network formation (solution viscosity, sol-gel transition) independently from chemical cross-linking by variation of the methacryloyl-to-acetyl ratio. It is known that temperature dependent physical network formation significantly influences the mechanical properties of chemically cross-linked GM hydrogels. We investigated the temperature sensitivity of GM derivatives with different degrees of modification (GM2, GM10), or similar degrees of modification but different methacryloyl contents (GM10, GM2A8). Rheological analysis showed that the low modified GM2 forms strong physical gels upon cooling while GM10 and GM2A8 form soft or no gels. Yet, compression testing revealed that all photo cross-linked GM(A) hydrogels were stronger if cooling was applied during hydrogel preparation. We suggest that the hydrophobic methacryloyl and acetyl residues disturb triple helix formation with increasing degree of modification, but additionally form hydrophobic structures, which facilitate chemical cross-linking.Item Open Access Studien zur biotechnologischen Anwendung und ökologischen Funktion von Pyrrolochinolinchinon(PQQ)-abhängigen Alkoholdehydrogenasen(2021) Wehrmann, Matthias; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Modelling and simulation of turbulent premixed combustion with stratification based on multiple mapping conditioning(2022) Straub, Carmen; Kronenburg, Andreas (Prof. Dr.)Item Open Access Hemmung von Bcr/Abl durch Imatinib führt zu einer Cisplatin-Sensitivierung und zu einer modulierten p53-Funktion bei Bcr/Abl-positiven Zellen(2009) Skorta, Ioanna; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Für die Pathogenese der chronisch myeloischen Leukämie (CML) ist die onkogene Kinaseaktivität von Bcr/Abl essentiell. Aufgrund der Tatsache, dass Bcr/Abl selektiv in malignen Zellen exprimiert wird und diese onkogene Tyrosinkinase kausal für die CML ist, stellt dieses Fusionsprotein einen hervorragenden Angriffspunkt für eine zielgerichtete Behandlung der Krankheit dar. Seit der Einführung im Jahr 2001 hat sich der Bcr/Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib Mesylat (Glivec®; GleevecTM; STI571) zum Goldstandard in der Primärtherapie der CML etabliert. Obwohl bisher große therapeutische Erfolge mit Imatinib bei Patienten mit CML in chronischer Phase erzielt werden konnten, ist nach aktuellem Erkenntnisstand keine Eliminierung aller leukämischen Zellen durch eine Imatinib-Monotherapie in Patienten möglich. Die Entwicklung neuer Behandlungs-Strategien, die eine vollständige Heilung der CML erzielt, ist nach wie vor von großer Bedeutung. Erfolgversprechend könnte die Kombination aus Imatinib und anderen Medikamenten, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, sein. In der vorliegenden Dissertation gelang erstmalig der Nachweis, dass eine Behandlung mit Imatinib zu einer Hypersensitivität gegenüber Cisplatin führt sowohl bei murinen Bcr/Abl positiven Zellen als auch in primären Philadelphia- positiven Progenitor-Zellen aus CML Patienten, die in diesem Ausmaß bisher nicht beschrieben wurde. Die Kombination aus Imatinib und Cisplatin führte bei Bcr/Abl-positiven Zellen zu einer extrem verstärken Induktion von Zelltod, während dieselbe Behandlung keine zusätzlichen Effekte bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte der durch eine Imatinib/Cisplatin- Behandlung vermittelte Viabilitätsverlust durch eine zusätzliche Inkubation mit dem Mdm2-Antagonisten Nutlin weiter verstärkt werden, sodass im Zellliniensystem ein fast 100 %-iger Zelltod und bei primären Zellen eine fast komplette Hemmung der Koloniebildung erreicht wurde. Interessanterweise ergab ein Vergleich der Cisplatin-Sensitivität der Bcr/Abl-positiven Zelllinie BaF3p185 in Anwesenheit von Imatinib mit der von anderen Tumorzelllinien, dass durch Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen eine Sensitivität erreicht wurde, die vergleichbar mit der extrem sensitiven Hodenzelllinie N-TERA war. Zur Charakterisierung möglicher Ursachen dieser Hypersensitivität Imatinib- behandelter CML Zellen gegenüber Cisplatin, wurden zunächst mögliche Alterationen der Regulation des Zellzyklusarrests nach Cisplatin-Behandlung untersucht. Cisplatin induzierte sowohl bei Bcr/Abl-positiven als auch bei Bcr/Abl-negativen Zellen einen G2/M-Arrest. Durch die Behandlung mit Imatinib kam es zu einem Verlust des G2/M-Arrests und zu einer schnellen Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen, während dieselbe Behandlung keinen Effekt auf den Cisplatin-induzierten G2/M-Arrest bei Bcr/Abl-negativen Zellen hatte. Darüber hinaus konnte mittels einer Analyse der einzelnen Zellgenerationen 24 h nach Cisplatin-Behandlung gezeigt werden, dass Bcr/Abl-positive Zellen bereits nach der ersten Zellteilung in der G2/MPhase arretierten und eine kleine Zellpopulation, vermutlich nach erfolgter Reparatur des DNASchadens, ohne signifikanten Verlust der mitochondrialen Integrität, eine dritte Zellteilung vollendet hatte. In Anwesenheit von Imatinib hingegen waren die Zellen nicht in der Lage in G2/M zu arretieren. Vielmehr kam es bereits nach der ersten Zellteilung zum Verlust der mitochondrialen Integrität infolge von Cisplatin. Es ist bekannt, dass es durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zur Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium und damit zu einem Caspase-abhängigen Todesmechanismus kommt. Interessanterweise verlief der Imatinib/Cisplatin-induzierte Zelltod bei Bcr/Abl-positiven Zellen unabhängig von Caspasen. Neben Cytochrom C wird auch AIF aus dem Mitochondrium freigesetzt, das in der Lage ist einen Caspase-unabhängigen Todesmechanismus zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es in Bcr/Abl-positiven Zellen infolge einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer AIFTranslokation in den Zellkern und somit zur Induktion von Zelltod kam. Als mögliche Ursache für den Verlust des G2/M-Arrests konnte eine verminderte ATMAktivierung infolge einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung selektiv bei Bcr/Abl-positiven Zellen identifiziert werden. Die verminderte Aktivierung von ATM führte zu einer Reduktion der p53-Phosphorylierung an Serin 15 und zu einer leichten Reduktion der p53-Induktion nach Cisplatin-Behandlung. Die verminderte p53-Phosphorylierung an Serin 15 hatte Konsequenzen auf die durch zellulären Stress hervorgerufene p53-Antwort, wobei es zu einer verminderten transkriptionellen Aktivität von p53 kam. Dies konnte durch die reduzierte Expression der p53-Zielstukturen, Mdm2 und p21, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene, gezeigt werden. Im Gegensatz zu Mdm2 und p21 waren die proapoptotischen p53-abhängigen Gene wie BAX, PUMA und NOXA bereits in Abwesenheit von zellulärem Stress hoch exprimiert und wurden durch eine Behandlung mit Cisplatin nicht weiter induziert. Auch eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit Imatinib hatte keine Auswirkungen auf die Expression von BAX, PUMA und NOXA. Demnach hat p53 auch keine transaktivierende Wirkung auf diese proapoptotischen Gene in diesem Zellsystem nach einer Behandlung mit Cisplatin. Dies bedeutet, dass die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor durch eine Behandlung mit Imatinib in Bcr/Abl-positiven Zellen gestört war. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte dennoch gezeigt werden, dass p53 für den hypersensitiven Phänotyp, der bei Bcr/Abl-positiven Zellen durch eine Imatinib/Cisplatin-Behandlung induziert wird, eine entscheidende Rolle spielt. p53 hat neben seiner Funktion als Transkriptionsfaktor im Zellkern auch im Zytoplasma eine wichtige Zelltod-induzierende Funktion. Im Zytoplasma ist p53 in der Lage durch die Bindung an pro- und antiapoptotische Proteine, unabhängig von seiner transkriptionellen Aktivität, BAX zu aktivieren und somit Zelltod zu induzieren. Voraussetzung für die Ausübung dieser Funktion ist eine Lokalisation von p53 im Zytoplasma. In dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass p53 nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung Bcr/Abl-positiver Zellen größtenteils im Zytoplasma akkumuliert. Der p53-Export aus dem Zellkern wird vermittelt durch eine verminderte p53-Phosphorylierung am Serin-Rest an Stelle 15, durch eine niedrige Mdm2-Proteinmenge und durch die Aktivierung von FoxO3a. Alle drei Mechanismen konnten in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Demnach wird die rasche Induktion von Zelltod durch zytoplasmatisches p53 vermittelt. Im Zytoplasma interagiert p53 mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-xL, wodurch eine Aktivierung von BAX durch p53 und somit die Induktion von Zelltod verhindert wird. Es konnte gezeigt werden, dass es selektiv bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Behandlung mit Imatinib und Cisplatin zu einer signifikanten Reduktion der Bcl-xL-Expression kam. Diese verminderte Expression von Bcl-xL führte wahrscheinlich zu einem Ungleichgewicht zwischen Bcl-xL und p53 zugunsten von p53, sodass vermehrt “freies“ p53 im Zytoplasma vorlag, das dann in der Lage war, BAX zu aktivieren und einen mitochondrialen Zelltod zu induzieren. Die entscheidende Rolle der verminderten Bcl-xL Expression für den hypersensitiven Phänotyp konnte dadurch belegt werden, dass eine exogene Expression von Bcl-xL, die das Gleichgewicht mit p53 wiederherstellte, ausreichend war, um den Verlust der mitochondrialen Membranintegrität und die Translokation von AIF zu verhindern. Die Induktion von Zelltod bei Bcr/Abl- positiven Zellen nach einer Imatinib/Cisplatin-Behandlung konnte dadurch signifikant reduziert werden. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass für die Induktion einer Tumorselektiven Hypersensitivität gegenüber Cisplatin zwei Signalwege von entscheidender Bedeutung sind. Durch die Hemmung des ATM/p53-Signalwegs sind Bcr/Abl-positive Zellen nicht mehr in der Lage, in der G2/M-Phase zu arretieren. Darüber hinaus vermittelt eine Cisplatin-Behandlung in Anwesenheit von Imatinib die Akkumulation von p53 im Zytoplasma und eine gleichzeitige Reduktion der Bcl-xL-Expression, was zu einer massiven Induktion von Zelltod führt. Die Befunde dieser Arbeit könnten auch für andere maligne Erkrankungen bedeutend sein. Aufgrund der Tatsache, dass bei vielen Tumoren Signalwege der DNA-Schadensprozessierung per se dereguliert sind, könnte die pharmakologische Hemmung eines weiteren Wegs zu einer vergleichbaren Hypersensitivität führen, wie sie in vorliegender Dissertation nach Hemmung der ATM/p53-Achse und der Bcl-xL-Expression beobachtet wurde. Da bei normalen Zellen durch diesen pharmakologischen Eingriff lediglich ein Weg gehemmt würde, der andere jedoch weiterhin intakt wäre, wäre diese Hypersensitivität tumorselektiv.Item Open Access A systems biology approach to analyse leaf carbohydrate metabolism in Arabidopsis thaliana(2011) Henkel, Sebastian; Nägele, Thomas; Hörmiller, Imke; Sauter, Thomas; Sawodny, Oliver; Ederer, Michael; Heyer, Arnd G.Plant carbohydrate metabolism comprises numerous metabolite interconversions, some of which form cycles of metabolite degradation and re-synthesis and are thus referred to as futile cycles. In this study, we present a systems biology approach to analyse any possible regulatory principle that operates such futile cycles based on experimental data for sucrose (Scr) cycling in photosynthetically active leaves of the model plant Arabidopsis thaliana. Kinetic parameters of enzymatic steps in Scr cycling were identified by fitting model simulations to experimental data. A statistical analysis of the kinetic parameters and calculated flux rates allowed for estimation of the variability and supported the predictability of the model. A principal component analysis of the parameter results revealed the identifiability of the model parameters. We investigated the stability properties of Scr cycling and found that feedback inhibition of enzymes catalysing metabolite interconversions at different steps of the cycle have differential influence on stability. Applying this observation to futile cycling of Scr in leaf cells points to the enzyme hexokinase as an important regulator, while the step of Scr degradation by invertases appears subordinate.Item Open Access Dimensions of proximity and localisation of knowledge-intensive producer services : the case of software services for automotive industry in Stuttgart region(2009) Tözün, Reha; Gaebe, Wolf (Prof. Dr. rer. pol.)This thesis primarily examines the spatiality of knowledge-intensive producer services within the framework of knowledge tacitness and aspatial proximities notions. Additionally, based on an example of a West-European location, it links aspatial proximities and regional structural change discourses and explores the significance of lead firms for regional agglomerations. Globalization operates on the significantly lowered trade barriers and mobility of goods, persons and information. In such an environment, knowledge-production and innovation are critical elements of industrial competitiveness, especially for developed countries in Western Europe. As it has been suggested since late 1980's, innovation has a strong interactive component and the knowledge-creation processes tend to localize geographically. However, such processes are do function over geographical distance as well; therefore one needs to consider the non-geographical influences to understand the dynamics involved. The aspatial proximities, which are categorized by Boschma along cognitive, social, organisational and institutional dimensions, provide an intriguing framework to handle the issues regarding the spatiality of knowledge-producing relations between economic actors. Despite the awareness regarding the role of interaction, theories on regional agglomeration phenomenon tend to be more attentive to the supply-side matters. However, the impulses and incentives from demand side do co-define the direction and extent of knowledge production efforts. With the important roles it assigns to local demand and customers, Porter's industrial clusters concept offers a theoretical background for the research interests of this study. Beside aspatial proximities and industrial clusters, this thesis draws on learning regions, long-waves of technological change and regional structural change literatures for its framework of analysis. For the empirical investigation software services for automotive industry in the Stuttgart region were selected. In-depth interviews with regional experts were adopted for the purposes of data collection. The knowledge-intensive producer services relations fundamentally depend on application- and customer-specific knowledge, which is often change-prone and not market-traded. The study revealed that the well-maintained aspatial proximities allow service providers to have sustained access to such knowledge. It was also found that the creation and maintenance of aspatial proximities is related to the availability of spatial proximity between actors and groups. As such, geographical space has a subtle and indirect effect on knowledge production in that it influences cognitive, social and organisational space through which knowledge is generated and shared. The management of aspatial proximities is also a crucial factor for the path-dependant agglomeration of services activities around existing production locations. The study also found out that the coordination challenges induced by the cognitive dynamics of knowledge-production processes strongly affect the spatial proximity requirements of interactive relations. Cognitive dynamics is defined by the tacitness of knowledge content and the processes characteristics. While tacitness creates the need for face-to-face exchanges, time constraints and interfaces between knowledge-production processes compel actors to have more frequent meetings. Under conditions where highly tacit knowledge content has to be co-produced and shared in short time intervals across numerous processes run by different teams, groups of actors are compelled to engage in more frequent face-to-face interaction in order to avoid knowledge mismatches and miscomprehension. As such, the serviceability of such relations decreases with distance and increasing geographical space between partners escalates transaction costs, which in return impels parties to locate near each other. However, the codifiability of knowledge content and the manageability of processes change these dynamics and spatial proximity becomes a choice rather than a requirement. Provided that their operations contain active technology-oriented and knowledge-production functions, lead firms can act as the nodes of regional knowledge-production networks in clusters. The evidence collected for this study suggests that besides acting as demanding local customers à la Porter, they actively co-develop innovations and enrich knowledge capital of a cluster.