The use of confocal Raman microscopy for the evaluation of in-vitro biofilm model structures

Abstract

In nature, the majority of microorganisms grow and accumulate on surfaces. These microorganisms are in general surrounded by an extracellular matrix, also generating a biofilm. Extensive research has been done to further understand these biofilms, especially those that cause human diseases such as subgingival biofilms where their accumulation on teeth over time can cause gingivitis and periodontitis. While dynamics, formation and composition of these biofilms are well known, techniques for continuously monitoring the formation of subgingival biofilm are limited. In recent years, advancements in the field of optical spectroscopic techniques have provided an alternative for analyzing three-dimensional microbiological structures, in addition to the traditional destructive or biofilm staining techniques. In this work, it was demonstrated that the use of confocal Raman spectroscopy, coupled with multivariate analysis, provides an approach to differentiate common subgingival bacteria. In addition, a workflow was developed that allows for the spatial differentiation of bacteria in an in vitro model simulating a subgingival biofilm, a technique which was also confirmed by mapping a second mixed species in vitro biofilm found on medical devices. The present work demonstrates the use of confocal Raman Microscopy to differentiate common subgingival bacterial species (Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans, Veillonella dispar and Prevotella nigrescens) and including their identification in unknown samples. In a second step, a workflow was established to evaluate and differentiate bacterial species in two dual-species in vitro biofilm models, using confocal Raman microscopy. The first biofilm model comprised of Actinomyces denticolens and Streptococcus oralis was cultured using the ‘Zürich in vitro model’. Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa were cultured as a second dual-species biofilm to confirm the established workflow. Both biofilms were then analyzed using confocal Raman Microscopy. Cluster analysis was used to spatially differentiate and map the biofilm models over a specified area. To confirm species clustering within the cultured biofilms, confocal laser scanning microscopy was coupled with fluorescent in-vitro hybridization. Furthermore, dense bacteria interface area samples, as an artificial model of clusters in a biofilm, were used to test the developed multivariate differentiation model. This confirmed model was successfully used to differentiate species in a dual-species biofilm that were additionally compared and confirmed by morphology analysis. The results show that the developed workflow was able to identify main clusters of bacteria based on spectral ‘fingerprint region’ information acquired from confocal Raman microscopy. Using this workflow, it was demonstrated that confocal Raman microscopy can be used to spatially analyze dual-species in vitro biofilms, thus providing an alternative technique to map biofilm models.

In der Natur akkumulieren die meisten Mikroorganismen mit Hilfe einer extrazellulären Matrix auf Oberflächen. Diese Akkumulation von Mikroorganismen ist auch als Biofilme bekannt. Zahlreiche Forschungsarbeiten wurden zu diesen Biofilmen durchgeführt, insbesondere zu denjenigen, die beim Menschen Krankheiten hervorrufen. Hierzu gehören subgingivale Biofilme, die durch ihre Ansammlung auf Zähnen im Laufe der Zeit zu Gingivitis und Parodontitis führen kann. Während Dynamik, Bildung und Zusammensetzung dieser Biofilme bekannt sind, gibt es nur wenige Methoden, die eine kontinuierliche Überwachung des Wachstums von subgingivalen Biofilmen ermöglichen. Fortschritte im Bereich der optischen Spektroskopie führten zu einer Alternative zur klassischen Analyse dreidimensionaler mikrobiologischer Strukturen, wie destruktive Methoden oder Biofilm-Färbetechniken. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Einsatz der konfokalen Raman-Spektroskopie in Verbindung mit einer multivariaten Analyse einen Ansatz zur Differenzierung gängiger subgingivaler Bakterien bietet. Darüber hinaus wurde ein Workflow entwickelt, der die räumliche Differenzierung von Bakterien in einem subgingivalen In-vitro Biofilmmodell ermöglicht. Dieser Prozess wurde an einem weiteren medizinisch relevanten In-vitro Biofilmmodell, bestätigt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einsatz der konfokalen Raman-Mikroskopie zur Differenzierung gängiger subgingivaler Bakterienarten (Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans, Veillonella dispar und Prevotella nigrescens) und die Identifikation von Arten in unbekannten Proben demonstriert. In einem zweiten Schritt wurde ein Workflow zur Bewertung und Unterscheidung von Bakterienarten in zwei unterschiedlichen In-vitro Biofilmmodellen mit zwei Spezies unter Verwendung der konfokalen Raman-Mikroskopie entwickelt. Das erste Biofilmmodell, bestehend aus Actinomyces denticolens und Streptococcus oralis, wurde mit dem "Zürich in vitro Modell" kultiviert. Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa wurden ebenfalls gemeinsam als Biofilm kultiviert, um den etablierten Workflow zu bestätigen. Beide Biofilme wurden mit konfokaler Raman-Mikroskopie analysiert. Mit Hilfe der Clusteranalyse wurden die Biofilmmodelle räumlich differenziert und dargestellt. Zur Validierung wurde die konfokale Laser Scanning Mikroskopie mit fluoreszierender In-vitro Hybridisierung eingesetzt. Darüber hinaus wurden Proben mit Bakteriengrenzflächen als Modell von Clustern in einem Biofilm verwendet, um das entwickelte multivariate Differenzierungsmodell zu testen. Dieses Modell wurde erfolgreich zur Differenzierung von Organismen in einem Zwei-Organismen Biofilm verwendet. Zusätzlich wurden die erhaltenen Ergebnisse mittels Morphologie-Analysen verglichen und bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der entwickelte Workflow geeignet war, die untersuchten Bakterien durch konfokale Raman-Mikroskopie zu identifizieren. Dies basiert auf den „Fingerprint Regionen“, die charakteristisch für verschiedene Spezies sind. Mit Hilfe dieses Workflows konnte gezeigt werden, dass die konfokale Raman Mikroskopie Zwei-Organismen Biofilme in vitro räumlich analysieren und darstellen kann und somit eine alternative Technik zur Darstellung von Multi-Organsimen Biofilmmodellen darstellt.