Mikrobielle Herstellung von cis-Dihydrodihydroxybenzoaten als Bausteine für die chemische Synthese

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren für die Herstellung von Phenol aus Toluol zu entwickeln. Das Verfahren sollte aus einem biologischen und aus einem chemischen Schritt bestehen. In dem biologischen Schritt sollte aus Toluol Dihydrodihydroxybenzoat (cis-cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol-1-carboxylat) produziert werden, welches in einem Folgeschritt durch Ansäuren zu Phenol umgewandelt werden kann. Für den biologischen Prozess stand am Anfang dieser Arbeit noch kein Bakterienstamm zur Verfügung, der Toluol zu DHB umzusetzen konnte. Deshalb wurde zunächst ein Verfahren entwickelt, bei dem in Fedbatch-Fermentationen mit Ralstonia eutropha B9 aus Benzoat als Ausgangssubstrat DHB in hohen Produktkonzentrationen hergestellt werden konnte (300 mmol·l-1). Dieser Benzoat-Verwerter ist im Benzoat-Katabolismus an der Stelle der Benzoat-Dehydrogenase blockiert. Wichtig hierfür war, dass die Phosphatpufferkonzentration des Mediums von 50 mmol·l-1 auf 1 mmol·l-1 reduziert wurde. Außerdem war die Verwendung eines Auxiliarsubstrats wichtig, dessen Abbau keine pH-Änderung während des Prozesses verursachte. Bei dieser relativ hohen Produktkonzentration ist es möglich geworden, durch eine einfache Aufarbeitungsmethode (Fällung mit Isopropanol) Na-DHB am Ende der Fedbatch-Fermentation in reiner kristalliner Form zu isolieren. Dieser zweistufige Prozess konnte auch erfolgreich zur Herstellung substituierter DHBs angewendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf industrieller Nachfrage 4-Fluor-DHB, 3,5-Difluor-DHB, 3-Methyl-DHB, 4-Methyl-DHB, 3,4-Dimethyl-DHB und 4-Chlor-DHB im 1 bis 5 g Maßstab und DHB im 60 g Maßstab produziert. Mit dem Stamm Ralstonia eutropha B9 wurden die fluorierten DHB hergestellt. Die methyl-substituierten DHB wurden mit einem von Whited et al. (1986) beschriebenen Stamm, Pseudomonas putida BGXM1, produziert. Für die Produktion von 4-Chlor-DHB kam der von A. Germer (Institut für Mikrobiologie, Universität Stuttgart) konstruierte Stamm Pseudomonas putida Idaho BDH2 zum Einsatz. Dieser Stamm zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass er Toluol zu DHB umsetzen kann. Die genetische Veränderung bestand in der Blockierung zweier DHB-Dehydrogenasen. Dieses Konstrukt wurde im Hinblick auf einen technischen Prozess näher untersucht. Nach Angaben von A. Germer konnte DHB mit einer Ausbeute von 25-40 % aus Toluol gewonnen werden, wenn Toluol als alleiniges Substrat bzw. Cosubstrat verwendet wurde. Bei einer weiteren Kultivierung (etwa 4 Tagen) wurde das entstandene DHB unter Bildung von Biomasse wieder abgebaut. Im Rahmen dieser Arbeit ist es lediglich gelungen 4 % DHB aus Toluol zu bilden und zwar mit sogenannten "Ruhezellen" von Pseudomonas putida Idaho BDH2. Diesen "Ruhezellen" wurde allerdings sowohl Glucose als auch Mineralsalze zugesetzt wurden. Wurde bei diesen Experimenten nur Toluol verwendet, war eine noch geringere Umsatzrate und eine noch niedrigere Ausbeute an DHB festzustellen. Deutlich höhere Ausbeuten an DHB (70%) wurden mit dem 4-Methylbenzoatverwertenden Stamm Pseudomonas putida BGXM1 erhalten. Dieser ist in der 4-Methylbenzoat-Katabolismus an der Stelle der 4-Methylbenzoat-Dehydrogenase blockiert. Für diesen Stamm, der ursprünglich für die Herstellung von Methyl-substituierten DHB eingesetzt wurde, konnte nachgewiesen werden, dass er DHB aus Toluol bildet. Allerdings war trotz identischer Anzucht- und Reaktionsbedingungen die Ausbeute von DHB stark vom Zustand der Zellen abhängig. Als Fazit der Untersuchungen ist festzustellen, dass die Herstellung von Phenol aus Toluol prinzipiell möglich ist. Die im Rahmen der Arbeit untersuchten Bakterienstämme, die Toluol zu DHB oxidieren, sind für einen technischen Prozess jedoch wenig geeignet. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Methode zur Herstellung von DHB kann durchaus für einen technische Einsatz z.B. für die Herstellung von Synthonen und Feinchemikalien verwendet werden.

The aim of the work was to develop a biotechnological process for the synthesis of phenol from toluene. This process contained two steps: in the first biotransformation step, toluene is transformed to dihydrodihydroxybenzoate (DHB, cis-cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol-1-carboxylate), which is further converted to phenol through acidification in the second step. At the beginning of the research, most of the available bacteriological strains were not able to perform the transformation of toluene into DHB. Therefore, the conversion of benzoate as a metabolite of toluene oxidation was investigated particularly with regard to the industrial requirement. A new process has been developed, during which it was possible to produce DHB in high concentration (approximately 300 mmol·l-1). The process is based on the transformation of benzoate through a fedbatch-fermentation with a mutant strain Ralstonia eutropha B9 which is blocked in the benzoic acid catabolism. To achieve this purpose it was important to reduce the Na-K-phosphate buffer concentration from 50 mmol·l-1 to 1 mmol·l-1. It was also necessary to use an auxiliary substrate, whose degradation did not alter the pH of the solution during the process. With such a high concentration of DHB it was possible at the end of the fedbatch-fermentation to isolate the DHB in a pure crystal form after a simple precipitation with isopropanol. The two steps-process was also successfully applied to synthesize DHB derivatives. 4-Fluoro-DHB; 3,5-difluoro-DHB; 3-methyl-DHB; 4-methyl-DHB; 3,4-dimethyl-DHB; and 4-chloro-DHB were produced in 1 to 5 g scale with a purity of 81 to 95 % in 1,4 l fedbatch fermentations. The unsubstituted DHB was also produced in 60 g scale with a purity of 95 % in 1,4 l fedbatch fermentation. The fluorine derivatives of DHB were produced with Ralstonia eutropha B9 (Reiner & Hegeman, 1971). Whited et al., (1986) have reported the production of the methyl derivatives of DHB with a strain Pseudonomonas putida BGXM1 which therefore was used for the DHB production. To achieve the 4-substituted chlorine derivative a new strain named Pseudomonas putida Idaho BDH2 (A. Germer, 2001 Institute of Microbiology, University of Stuttgart) was used. The novel characteristic of the latter strain is its capacity to transform directly toluene to DHB. In order to perform the required genetical modification of the strain it was necessary to block two DHB-dehydrogenases. Pseudomonas putida Idaho BDH2 was tested in view of a technical process. According to the statement of A. Germer the production of 25-40% DHB from toluene was possible when toluene was offered as the only substrate in the medium. However, the DHB which accumulated was further metabolized by the strain accompanied by biomass formation. In the present work only 4% DHB was produced by Pseudomonas putida Idaho BDH2 when the growth medium was supplemented with glucose and mineral salts in addition to toluene. In contrast to this, when toluene was used as a sole substrate in the medium, the yield and the rate of the transformation was higher (A. Germer, 2001 Institute of Microbiology, University of Stuttgart). Better yields and rates were reached with strain Pseudomonas putida BGXM1 (Whited et al., 1986), in which the catabolism of 4-methylbenzoic acid is blocked. Initially, the strain was used for the production of 4-methyl-DHB but later it was found that it can also produce DHB from toluene. In conclusion, the production of phenol from toluene is theoretically possible. Most of the tested strains, were able to oxidize toluene to DHB but none of them was qualified for the production in technical scale. In the present research work a novel method was developed to produce DHB derivatives from different substituted benzoates, which might be interesting for the commercially production of such compounds as synthons or fine chemicals.