Photic and non-photic inputs to the suprachiasmatic nucleus of the rat: role of the serotonergic system

Abstract

In mammals, circadian rhythms are controlled by a master clock localized in the suprachiasmatic nucleus (SCN) and entrained to 24 h by external cues. These signals are conveyed by three main afferences: the retinohypothalamic tract (RHT), the geniculohypothalamic tract (GHT) and the serotonergic tract. Photic factors during the night, leading to glutamate release from the RHT and c-Fos and clock gene expression in the SCN, induce phase shifts of the locomotor activity rhythm. Non-photic factors during the day generally induce phase advances of the locomotor activity rhythm and involve serotonin (5-HT) release from the serotonergic tract. Photic and non-photic factors can interact and modulate their respective effects. The purpose of my thesis is to better understand the mechanisms underlying these interactions. In the first part of this work, we have investigated the interaction between a photic factor and a non-photic factor on different circadian parameters in mice exposed to a light-dark cycle and fed daily with a diurnal hypocaloric diet (hypocaloric-fed mice). Compared to control animals fed ad libitum, the hypocaloric-fed mice showed phase changes of the locomotor activity, the melatonin secretion and the vasopressin expression rhythms and showed significant phase advances of two clock gene expression. There were also changes of light-induced phase shifts of the locomotor activity rhythm and light-induced clock gene expression in hypocaloric-fed mice. Thus, diurnal hypocaloric feeding is a non-photic factor able to modulate the synchronizing effects of light in the mouse. Lesion of serotonergic afferences to the SCN induces a marked reduction of the phase shifting effects of the diurnal hypocaloric feeding, implicating 5-HT in the neuronal mechanisms underlying these effects. In rats, 5-HT agonists are known to mimic the effect of light on various parameters of the SCN. We thus proposed that 5-HT could play a role in the functional interaction between photic and non-photic factors in the SCN and we thus studied the neuronal mechanisms mediating the photic-like shifting effects of 5-HT in the rat. In the second part of this work, we first tried to localize the 5-HT receptors implicated in these photic-like effects. As serotonergic agonists act directly in the SCN, these receptors can be either presynaptic or postsynaptic. To test the presynaptic hypothesis, we studied the phase shifting effects of a non-specific serotonergic agonist, the quipazine, in animals bearing lesions of either the serotonergic afferences, the GHT or the RHT. Our results implicate the RHT suggesting that the 5-HT receptors involved are localized on terminals of this tract. The possible serotonergic receptor subtype involved in these photic-like effects of 5-HT could be the 5-HT3 receptors since they have been shown in other brain structure to be localized on glutamatergic terminals and to induce glutamate release. Our results obtained with a specific 5-HT3 agonist and a specific 5-HT3 antagonist on several circadian parameters demonstrate the implication of the 5-HT3 receptor in the photic-like resetting effects of quipazine on the locomotor activity rhythm. However, another 5-HT receptor subtype seems to be involved in the induction of c-FOS expression by quipazine. In addition, we found that NMDA receptors, which are activated by glutamate release, participate in the phase advance of the locomotor activity rhythm and in the c-FOS expression in the SCN, induced by quipazine injection. Thus, the resetting effects of 5-HT in rats are mediated by presynaptic 5-HT3 receptors localized on the RHT terminals that trigger glutamate release, thus producing photic-like behavioral shifts.

Circadiane Rhythmen werden bei allen Säugetieren durch einen endogenen Schrittmacher im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) erzeugt und durch Umweltreize, sogenannte Zeitgeber, auf den 24 h-Rhythmus der Umwelt synchronisiert. Der wichtigste natürliche Zeitgeber ist der Licht-Dunkelwechsel, der bei allen Säugetieren über die Augen wahrgenommen wird. Nach neuesten Erkenntnissen wird die für das circadiane System relevante Lichtinformation nicht über die klassischen Photorezeptoren (Zapfen und Stäbchen) wahrgenommen, sondern über spezialisierte Ganglienzellen. Die Weiterleitung der Lichtinformation von der Retina an den SCN erfolgt über drei neuronale Afferenzen: den retinohypothalamischen Trakt (RHT), den geniculohypothalamischen Trakt (GHT) sowie über serotonerge Bahnen vom Nucleus raphe. Nach dem heutigen Wissensstand bewirken photische Stimuli während der Nacht die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat aus den Endigungen des RHT. Dies führt zur Aktivierung von induzierbaren Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise c-Fos, was wiederum die Expression diverser Uhrengene im SCN verändert und so zu einer Phasenverschiebung des circadianen Rhythmus führt. Je nach Richtung der Phasenverschiebung spricht man von Phasenbeschleunigung oder -verzögerung. Während des Tages führen nicht-photische Stimuli über die Freisetzung von Serotonin (5-HT) aus den Endigungen der serotonergen Bahn in der Regel zu Phasenbeschleunigungen, wobei sich photische und nicht-photische Stimuli auch gegenseitig beeinflussen können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Mechanismen der gegenseitigen Beeinflussung von photischen und nicht-photischen Stimuli genauer zu untersuchen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Interaktion zwischen photischen und nicht-photischen Stimuli an Mäusen untersucht, bei denen ein 24 h Licht-Dunkelwechsel mit einer auf die Lichtphase beschränkten Fütterung einer energiearmen Diät (hypocalorie-fed mice) kombiniert wurde. Als Messgrößen für den circadianen Rhythmus wurden der Aktivitätsrhythmus, die nächtliche Melatoninausschüttung und die Expression des Neurotransmitters Vasopressin im SCN untersucht. Außerdem wurden die Expressionsmuster verschiedener Uhrengene (Per1, Per2, Bmal1, Cry2) im SCN untersucht. Im Gegensatz zu den ad libitum gefütterten Kontrolltieren, zeigten die Mäuse mit Futterrestriktion Phasenverschiebungen im Aktivitäts- und Melatonin-, und Vasopressin-Rhythmus sowie in der Expression verschiedener Uhrengene. Die Ergebnisse zeigen, dass restriktive Fütterung mit einer energiearmen Diät ein nicht-photischer Stimulus ist, der den synchronisierenden Einfluss des Licht-Dunkelwechsels modifizieren kann. Läsionen der serotonergen Afferenzen zum SCN reduzierten die oben beschriebene phasenverschiebende Wirkung der restriktiven Fütterung. Dies ließ vermuten, dass die serotonerge Innervation des SCN an der Vermittlung dieses nicht-photischen Stimulus beteiligt ist. Außerdem war bereits bekannt, dass 5-HT Agonisten wie Quipazin oder DOI bei Ratten eine lichtähnliche Wirkung auf verschiedene circadiane Parameter, wie z.B. die Aktivitäts- oder Melatoninrhythmik, haben. Daraus ergab sich die Arbeitshypothese, dass 5-HT ein wichtiger Neurotransmitter bei der Verarbeitung und bei der Interaktion von photischen und nicht-photischen Eingängen in den SCN ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden daher die neuronalen Strukturen bzw. Rezeptoren genauer charakterisiert, die an der lichtähnlichen Wirkung von 5-HT beteiligt sind. Ein früherer Befund, dass 5-HT Agonisten direkt am SCN wirken, lässt sich sowohl über präsynaptische wie postsynaptische 5-HT Rezeptoren im Bereich des SCN erklären. Um die mögliche Beteiligung präsynaptischer Rezeptoren zu testen, wurde zunächst der phasenverschiebende Effekt von Quipazin, einem unspezifischen 5-HT Agonisten, bei Ratten mit Läsionen des RHT, des GHT oder der 5-HT Afferenzen untersucht. Dabei zeigte sich, dass weder Läsionen des GHT, noch der 5-HT Afferenzen Auswirkungen auf die Phasenverschiebung im Aktivitätsrhythmus oder die c-Fos Expression im SCN hatten. Nur nach bilateraler Läsion des RHT konnten keine Phasenverschiebungen mehr ausgelöst werden und die c-Fos Expression im SCN entsprach der von unbehandelten Kontrolltieren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Quipazin über präsynaptischen Rezeptoren auf den Nervenendigungen des RHT wirkt. Als möglicher Kandidat wurde der 5-HT3 Rezeptor angesehen, da für diesen Rezeptortyp bereits bekannt war, dass er in anderen Bereichen des Gehirns als präsynaptischer Rezeptor auf glutamatergen Nervenendigungen die Freisetzung von Glutamat fördert. Weitere Versuche mit 5-HT3 spezifischen Agonisten und Antagonisten galten daher der genaueren pharmakologischen Charakterisierung. Die Ergebnisse zeigten, dass zumindest der Aktivitätsrhythmus der Tiere durch Gabe eines 5-HT3 spezifischen Agonisten verschoben werden konnte und dass die phasenverschiebende Wirkung von Quipazin durch einen 5-HT3 spezifischen Antagonisten blockiert werden konnte. An der gleichzeitig untersuchten Aktivierung von c-Fos im SCN scheint jedoch noch mindestens ein weiterer 5-HT Rezeptor beteiligt zu sein, da die Vorbehandlung mit einem 5-HT3 spezifischen Antagonisten die durch Quipazin induzierte c-Fos Expression nicht komplett blockierte. Mögliche Kandidaten sind postsynaptisch lokalisierte 5-HT7 bzw. 5-HT2C Rezeptoren. So gibt es bereits eine Reihe von Veröffentlichungen, die zeigen, dass 5-HT2C spezifische Agonisten und Antagonisten die phasenverschiebende Wirkung von Licht simulieren bzw. inhibieren können. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Glutamat-Rezeptoren vom NMDA-Subtyp an der Wirkung von Quipazin auf die Aktivitätsrhythmik und auf die c-Fos Expression im SCN beteiligt sind, da die lichtähnliche Wirkung von Quipazin durch den spezifischen Antagonisten MK-801 blockiert werden konnte. Daraus ergab sich die Schlussfolgerung, dass die durch 5-HT bewirkten Phasenverschiebungen der circadianen Rhythmik durch die Aktivierung von präsynaptischen 5-HT3 Rezeptoren auf den Terminalen des RHT und die dadurch induzierte Freisetzung von Glutamat vermittelt werden. Abschließend wurde untersucht, welchen Effekt Quipazin und ein 5-HT3 spezifischer Agonist auf die Expression verschiedener Uhrengene haben. Hier zeigte sich lediglich eine Steigerung in der Expression von Per1. Zusammenfassend zeigen die gewonnenen Ergebnisse, dass die Synchronisation der nicht?photischen Stimuli erfolgt. Speziell unter natürlichen Umweltbedingungen sind nicht nur der Licht-Dunkelwechsel, sondern auch andere Umweltfaktoren, wie z.B. ein eingeschränkter Zugang zu Futter, von großer Bedeutung für den Überlebenserfolg eines Tieres. Insofern ist es nur sinnvoll, dass auch nicht-photische Stimuli das circadiane System beeinflussen können und so die Anpassung an die Umwelt unterstützen. Diese nicht-photischen Stimuli werden vermutlich durch verschiedene neuronale Eingänge vermittelt, wobei die serotonergen Afferenzen zum SCN von besonderer Bedeutung sind, weil sie die Funktionalität des circadianen Systems über unterschiedliche 5-HT Rezeptoren beeinflussen können.