Dynamics and regulation of the central carbon metabolism in Escherichia coli during fed-batch cultivations

Abstract

In the current thesis a systems biology approach was chosen for the analysis of the dynamics of the central carbon metabolism and its regulation in Escherichia coli during industrially relevant fed-batch processes. The two main goals were (i) to reconstruct the network structure of global regulation of the central carbon metabolism based on experimental and mathematical methods, and, (ii) to develop an approach for dynamic modeling the transcription of the central carbon metabolism genes.

A set of glucose-limited fed-batch processes was performed applying a constant feed rate to provide the same conditions for all examinations. This process strategy leads to a continuous reduction in the glucose availability. Complementary metabolic flux and global transcription analyses revealed that the fluxes and most transcript levels in glycolysis, the pentose phosphate pathway and the biosynthesis strongly decrease. Fluxes in the TCA cycle remained constant and mRNA levels of TCA cycle and glyoxylate shunt genes increased. Moreover, the signaling dynamics were examined by quantification of the intracellular concentrations of the alarmones ppGpp and cAMP. Strong accumulation of both alarmones was observed at the onset of carbon limitation. A new finding was the subsequent resetting of the signals.

A network structure of regulation of the central carbon metabolism was reconstructed to enable a comprehensive explanation of the observed dynamics. Accordingly, the cra and crp modulons majorly determine the transcription of glycolysis, TCA cycle and glyoxylate shunt genes. The relA/spoT modulon mainly regulates protein biosynthesis and the specific growth rate. The key cellular components, involved in the signaling and resetting of the alarmone concentrations, were integrated into this model structure. Further, well-known regulatory phenomena concerning the carbohydrate transport systems and chemotaxis were observed, whereas the stress and starvation response were of only minor relevance. These cellular functions are discussed to be interconnected with the precursor and energy supply.

The rRNA and total RNA contents were quantified using a newly developed method. A strong growth rate-dependent regulation of both rRNA and mRNA was concluded from these data. Therefore, the network structure was extended by the growth rate-dependent regulation via RNA polymerase availability.

The second step towards dynamic modeling the regulation of central carbon metabolism genes was the development of a novel modeling framework that enables to consider multiple regulation of transcription (by regulator proteins, RNA polymerase availability and multiple promoters). The novelty lies particularly in the prediction of kinetic parameters from the nucleotide sequences of the specific DNA-binding sites of the regulator proteins. The predictive power of this approach is demonstrated by the agreement of simulated and experimentally determined mRNA concentrations of the cra modulon. Moreover, the experimental data of the total RNA content support the model predictions concerning the growth rate-dependent regulation. The model predicts a strong Cra regulator protein-dependent regulation of the central carbon metabolism genes, which is superimposed by the growth rate-dependent regulation. The concentration of the Cra protein inhibitor fructose 1,6-bis(phosphate) was quantified for the first time in fed-batch cultivations. Its concentration fell significantly, which supports the hypothesis of its key role in signaling glucose availability.

The thesis provides an improved, quantitative understanding of the dynamics and regulation of the central carbon metabolism of E. coli in fed-batch processes. The proposed network structure may support further dynamic modeling of cellular functions interrelated with the supply of precursors and energy. The presented modeling framework is especially suitable for modeling large cellular networks and could make an impact on metabolic engineering of gene regulation in producer strains.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein systembiologischer Ansatz verfolgt, um die Dynamik des zentralen Kohlenstoffmetabolismus und dessen Regulation in Escherichia coli in industrielle wichtigen Fed-Batch Prozessen zu analysieren. Die zwei zentralen Ziele waren (i) die Netzwerkstruktur der globalen Regulation des Zentralstoffwechsels basierend auf experimentellen und mathematischen Methoden zu rekonstruieren und (ii) eine Methode zur dynamischen Modellierung der Transkription der Zentralstoffwechsel-Gene zu entwickeln.

Eine Reihe von Glukose-limitierten Fed-Batch Prozessen mit konstanter Zulaufrate wurde durchgeführt, womit gleiche Bedingungen für alle Experimente geschaffen wurden. Diese Prozessstrategie führt zu einer kontinuierlichen Abnahme der Verfügbarkeit der Glucose. Komplementäre metabolische Fluss- und globale Transkriptionsanalysen zeigten, dass die Stoffflüsse und die meisten Transkript-Level der Glykolyse, des Pentosephosphat-Weges und der Biosynthesen stark abfallen. Die Flüsse im Citrat-Zyklus bleiben konstant und die mRNA Level der Citrat- und Glyoxylat-Zyklus Gene sind erhöht. Weiterhin wurde die Signalbildungsdynamik durch Quantifizierung der intrazellulären Konzentrationen der Alarmone ppGpp und cAMP untersucht. Beim Einsetzen der Kohlenstofflimitation akkumulierten beide Alarmone stark. Ein neuer Befund war die anschließende Rückstellung beider Signale.

Eine Netzwerkstruktur der Regulation des zentralen Kohlenstoffmetabolismus wurde rekonstruiert, um damit die beobachtete Dynamik umfassend beschreiben zu können. Demgemäß bestimmen vorwiegend die cra und crp Modulons die Transkription der Glykolyse, Citrat- und Glyoxylat-Zyklus Gene. Das relA/spoT Modulon reguliert hauptsächlich die Proteinbiosynthese und die spezifische Wachstumsrate. Die zentralen, an der Signalbildung und –Rückstellung beteiligten, Komponenten wurden in diese Modellstruktur integriert. Weitere, gut untersuchte regulatorische Phänomene bezüglich der Kohlenhydrat-Transportsysteme und der Chemotaxis wurden beobachtet, während die Stress- und Stationärphasen-Regulation von untergeordneter Rolle waren. Die möglichen Interaktionen dieser Zellfunktionen mit der Versorgung mit Biosynthese-Vorstufen (precursor) und Energie werden diskutiert.

Die rRNA- und die Gesamt-RNA-Gehalte wurden durch eine neu entwickelte Methode quantifiziert. Eine starke Wachstumsraten-abhängige Regulation der rRNA und mRNA Transkription wurde aus diesen Daten abgeleitet. Daher wurde die Netzwerkstruktur um die Wachstumsraten-abhängige Regulation, über die Verfügbarkeit der RNA Polymerase, erweitert.

Der zweite Schritt hin zur dynamischen Modellierung der Regulation der Zentralstoffwechsel-Gene war die Entwicklung eines neuen Modellierungskonzepts, welches die Berücksichtigung der multiplen Regulation der Transkription (durch Regulatorproteine, die RNA Polymerase Verfügbarkeit und multiple Promotoren) erlaubt. Der Neuigkeitswert liegt insbesondere in der Prädiktion kinetischer Parameter aus der Nukleotid-Sequenz der spezifischen DNA-Bindestellen der Regulatorproteine. Die Vorhersagekraft der Methode wird durch übereinstimmende simulierte und experimentell bestimmte RNA Konzentrationen des cra Modulons demonstriert. Darüberhinaus werden die Modellvorhersagen betreffend der Wachstumsraten-abhängigen Regulation durch die experimentellen Daten der Gesamt-RNA gestützt. Das Model sagt eine starke Cra-Regulatorprotein-abhängige Regulation der Zentralstoffwechsel-Gene voraus, welche der Wachstumsraten-abhängigen Regulation überlagert ist. Die Konzentration des Cra-Protein-Inhibitors Fructose 1,6-bis(phosphat) wurde zum ersten Mal im Fed-Batch Prozess quantifiziert. Die Konzentration fiel signifikant ab, was die Hypothese über dessen Schlüsselrolle für die Signalbildung bei Glukose-Limitation bestätigt.

Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein verbessertes, quantitatives Verständnis der Dynamik und Regulation des zentralen Kohlenstoffmetabolismus in E. coli in Fed-Batch Prozessen entwickelt. Die vorgeschlagene Netzwerkstruktur stellt eine Grundlage für die weitere dynamische Modellierung zellulärer Funktionen, die mit der Versorgung von Biosynthese-Vorstufen und Energie zusammen hängen, zur Verfügung. Das eingeführte Modellierungskonzept eignet sich speziell zur Modellierung großer zellulärer Netzwerke und könnte dazu beitragen, das „Metabolic Engineering“ der Genregulation in Produzentenstämmen weiter voranzutreiben.