FCS investigations on the diffusional behaviour of TNF-Receptors upon stimulation in living cells

Abstract

In a cell many biochemical and biophysical processes like signal transduction or the assembly of supramolecular structures are driven by diffusion. To gain insight in these processes it is necessary to obtain information about the diffusion coefficients and the concentrations of the involved molecules. The method of choice to observe diffusion processes and quantifying concentrations is the fluorescence correlation spectroscopy (FCS) which analyses the time-dependent intensity of a fluorescent molecule diffusing through the focus of a strongly focused laser beam by calculating the autocorrelation function (ACF) of the fluorescence. The ACF contains all relevant information about the diffusing molecules like the diffusion coefficient, concentration and other intramolecular properties which influences its fluorescence properties. Derived and firstly applied to measure diffusion processes and chemical kinetics of DNA-drug intercalation in the early seventies [1;2] FCS has recently experienced growing popularity in physical, biochemical and biological applications. The non-invasive character of FCS combined with a lateral resolution of a few hundred nanometres makes this method also a powerful tool for investigations within living cells. It was demonstrated that the application of two-photon excitation (2PE) offers an alternative in biological applications of FCS [3;4]. Due to reduced photobleaching, light scattering and autofluorescence 2PE particularly impro-ves the signal in thick and turbid specimens such as cells and tissues.

Due to significantly improved signal-to-noise ratio and single molecule sensitivity [5] FCS became a widely used method in the field of single molecule physics. The applications of FCS include the investigation of binding of protein subunits [6], conformational changes [7;8], protein oligomerisation [9], as well as the observation of quantum effects like bunching and anti-bunching of photons emitted by a single quantum system [10;11].

In this work the diffusion behaviour of the tumour necrosis factor receptor type 1 and type 2 (TNF-R1, TNF-R2) have been examined in living cells before and after stimulation with their ligands sTNF and cysTNF, respectively, with FCS and 2PE. The transmembrane proteins TNF-R1 and TNF-R2 are members of the TNF receptor family capable of initiating apoptosis, the programmed and controlled cell death. Apoptosis plays an important role for the development of all multicellular organisms whereby unwanted or abnormal cells are eliminated during normal development of the organism. Stimulation of TNF-R1 and TNF-R2 represents the first step in the signalling cascade starting the apoptotic process of a cell. For investigating the function of the cytoplasmic domain of TNF-R1 and TNF-R2 the diffusion behaviour of mutants which lacked the complete cytoplasmic domain were investigated. It was also examined the diffusion behaviour of the tumour necrosis factor receptor associated factor type 2 (TRAF2) a cytoplasmic protein which appears to be capable of negatively regulating the apoptotic process by interacting with TNF-R2. For the investigations with FCS the cells were transiently transfected with a plasmid which bore the encoded protein, TNF-R1, TNF-R2 or TRAF2, fused with EGFP or ECFP as a fluorescent probe.

Diffusionsprozesse sind in Zellen an vielen biochemischen und biophysikalischen Vorgängen wie Signaltransduktion oder der Bildung von supramolekularen Komplexen beteiligt. Eine genaue Untersuchung dieser Prozesse, z.B. die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten und Konzentration der beteiligten Moleküle, ist daher unerlässlich für deren Verständnis. Die geeignetste Methode zur Untersuchung von Diffusionsprozessen ist wohl die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS). Bei dieser Methode wird die Autokorrelationsfunktion (autocorrelation function, ACF) der Fluoreszenz-fluktuation in einem festen Beobachtungsvolumen bestimmt, aus deren Verlauf sich dann die relevanten Parameter bestimmen lassen.

In der vorliegenden Arbeit werden das Diffusionsverhalten der Tumor-Nekrose-Faktor Rezeptoren vom Typ 1 und 2 (TNF-R1, -R2) sowie des TNF-R assoziier-tem Faktor Typ 2 (TRAF2) in lebenden Zellen untersucht. Diese Untersuchungen umfassen das Verhalten der Rezeptoren vor und nach Stimulation mit ihrem Liganden sTNF und cysTNF. Die beiden membranständigen Rezeptoren sind Mitglieder der an der Apoptose beteiligten TNF-Rezeptorfamilie. Die Stimulation der Rezeptoren stellt dabei den ersten Schritt einer Signalkaskade dar, die schließlich das kontrollierte Absterben und die kontrollierte Entsorgung der toten Zelle und deren Bestandteile zur Folge hat. Das Protein TRAF2 hingegen ist ein cytoplasmatisches Protein, das durch Wechselwirkung mit TNF-R2 den Apoptoseprozess negativ regulieren kann. Zur Untersuchung mittels FCS lagen die Proteine als Fusionsproteine, fusioniert mit EGFP und ECFP, in der Zelle vor. Der Einfluss der Mikroumgebung auf das Diffusionsverhalten der Proteine wurde ebenfalls untersucht. Dazu wurden die Zellen mit 2-Methylcyclodextrin (MCD) sowie CytochalsinD (cytD) behandelt. Dies führt bei MCD zu einer Verringerung des Cholesterinanteils in den Zellmembranen bzw. bei cytD zu einer Depolimerisation der Actinfilamente in der Zelle selbst. Weiterhin wurden die Zellen mit der fluoreszenzmarkierten Untereinheit B des Choleratoxins (CT-B) behandelt, das spezifisch an die Glycosphingolipide der Membranen, Bestandteile von Cholesterin-reichen Membranbereichen (sog. lipid rafts), bindet, um deren Rolle bei der Diffusion der Rezeptoren zu untersuchen.