Entwicklung hochsensitiver Biosensoren für neurotoxische Insektizide in Lebensmitteln : enzymatische in-vitro Aktivierung von Phosphorthionaten mit der Monooxygenase P450-BM3 und Sensitivitätssteigerung durch Proteindesign von Acetylcholinesterase

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines sensitiven AChE-Biosensors für den quantitativ summarischen Nachweis neurotoxischer Organophosphate und Carbamate in Lebensmitteln und Säuglingsnahrung.

Für die Untersuchung von Lebensmittelproben musste ein Verfahren entwickelt werden, welches unspezifische Matrixeinflüsse verhindert. Dies gelang durch Eingliederung einer Elektrodenbehandlung mit dem Tensid Tween 20 in das Testprotokoll. Dieser Schritt reduzierte die Probenvorbehandlung auf ein Minimum und lieferte ausgezeichnete Wiederfindungsraten von durchschnittlich 85% in den getesteten Lebensmittelproben. Der Biosensortest wurde mit Realproben vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart erfolgreich validiert. Die Anwendbarkeit konnte im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem CVUA Stuttgart gezeigt werden, in der Babybrei-Proben aus vier Ländern untersucht wurden. Hierbei wurden drei Überschreitungen des EU-Grenzwertes für Säuglingsnahrung festgestellt.

Für Phosphorthionate konnte eine neuartige Aktivierungsmethode entwickelt werden. Phosphorthionate stellen den Hauptanteil der als Insektizide eingesetzten Organophosphate dar, sind in ihrer ursprünglichen Form dem AChE-Hemmtest aber nicht zugänglich. Die Dreifachmutante F87V, L188Q, A74G war im Gegensatz zum Wildtyp Cytochrom P450 BM-3 in der Lage, die Oxidation von Phosphorthionaten in die korrespondierenden starken AChE-Inhibitoren zu katalysieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC-MS/MS ergab eine quasi quantitative Umsetzung von Parathion und Chlorpyrifos zu Paraoxon bzw. Chlorpyrifos-oxon. Der indirekte Nachweis der enzymatisch aktivierten Phosphorthionate über die AChE-Hemmwirkung lieferte eine Transformationseffizienz von 85% für Parathion und 99% für Chlorpyrifos. Dieses Verfahren wurde erfolgreich in Lebensmittelproben getestet. Dies bedeutet eine deutliche Steigerung des Analytspektrums von AChE-Biosensoren.

Die Sensitivität des AChE-Biosensors konnte durch Protein-Design von Nippostrongylus brasiliensis AChE gesteigert werden. Es wurden zehn Einfachmutanten und eine Mutante mit zusätzlicher Insertion von 26 Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese hergestellt und in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Ausbeute des Wildtyps konnte durch optimierte Kultivierungsbedingungen in einem 5L Fermenter auf 0,6 g/L gesteigert werden. Dieser Wert liegt deutlich über allen bislang erreichten Expressionsraten rekombinanter AChEn. Die AChE-Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber den 11 wichtigsten Organophosphaten und Carbamaten getestet. Die Mutation M301(288)A in der Acyltasche des aktiven Zentrums der AChE lieferte die insgesamt sensitivste Mutante. Gegenüber Omethoat ergab sich eine 108-fache Sensitivitätssteigerung. Die Sensitivität gegenüber Pirimiphos-methyl konnte ebenfalls um zwei Größenordungen gesteigert werden. Insgesamt konnte die Sensitivität gegen 10 von 11 getesteten Insektizide erhöht werden. Damit konnte das Ziel, Konzentrationen im Bereich des Pestizidgrenzwertes von Säuglingsnahrung von 10 µg/kg zu detektieren, für acht 8 der 11 getesteten Insektizide erreicht werden.

The objective of this work was to develop a sensitive AChE-biosensor for the detection of organophosphates and carbamates in food samples, which is suitable for monitoring infant food and covers the detection of phosphorothionates in food.

Matrix effects could be eliminated with a special electrode treatment. An additional incubation in tween-20 solved problems concerning a prolonged equilibration time of the electrodes and reduced recoveries which appear without the tween-20 treatment. The proper performance of the test was verified by analyzing several food samples to which different amounts of paraoxon in the concentration range between 5 and 20 µg/kg were added. The inhibition values correlated well with the standard inhibition curve of electric eel AChE in buffer solution, yielding a mean recovery rate of 85% in the analysed food samples. The test was successfully validated with 26 fruit and vegetable samples from the Chemical and Veterinary Official Laboratory (CVUA) Stuttgart, Germany (“Chemisches und Veterinär-Untersuchungsamt Stuttgart”), which were previously analyzed with traditional chromatographic methods. The developed biosensor method proved sensitive enough to be applied in the analysis of infant food samples. An analysis of 23 infant food samples were performed together with the CVUA Stuttgart. Three violations of the maximum residue limit of 10 µg/kg valid in the EU for infant food were observed.

A novel enzymatic activation method for phosphorothionates has been developed to allow for their detection with AChE biosensors. A genetically engineered triple mutant of cytochrome P450 BM-3 could convert phosphorothionates into their oxo-variants whereas the wild-type protein was unable to do so. Analysis of the transformation products by GC-MS/MS showed a quasi quantitative transformation of parathion and chlorpyrifos to paraoxon and chlorpyrifos oxon, respectively. Additionally the activation of phosphorothionates in aqueous solutions by the P450 BM-3 mutant was investigated with a subsequent optical AChE assay according to Ellman et al. Chlorpyrifos, chlorpyrifos methyl, methidathion and parathion were chosen because they are often found in fruit and vegetables. Phosphorothionate concentrations in the range between 1 and 100 µg/kg led to the inhibition of AChE after activation with the P450 BM-3 mutant. Non-activated parathion did virtually not lead to any inhibition of AChE. The novel enzymatic activation method could also be successfully applied for the analysis of food samples. This substantially increases the spectrum of analytes that can be detected by biosensors.

The sensitivity of the AChE-biosensor could be increased by site-directed mutagenesis of Nippostrongylus brasiliensis AChE. Ten single mutants and one mutant consisting of a single mutation in combination with an insertion of 26 amino acids were created and functionally expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Optimized expression conditions in a 5L fermenter yielded in an expression rate of 0,6 g/L. This is by far the highest expression rate which was achieved so far for an AChE. The mutations were introduced in four different parts of the active site, namely in the acyl pocket, the choline binding site, the peripheral anionic site and at the narrow substrate access gorge. The 11 mutants were analyzed according to their sensitivity towards the 11 most relevant organophosphates and carbamates. A replacement of methionine by alanine in the acyl pocket of the active center (M301(288)A) resulted in the overall most sensitive mutant. M301(288)A showed a 100-fold increased sensitivity towards omethoate. Altogether the sensitivity could be increased towards 10 out of 11 insecticides.