Quantitative coherent anti-Stokes Raman scattering micro-spectroscopy : theory and applications

Abstract

Among those spectroscopy techniques that use visible or infrared light, vibrational techniques like spontaneous Raman scattering spectroscopy offer the great advantage of being label-free, and thus allow obtaining information regarding the physics or chemistry of a sample of interest without any sample preparation. However, the disadvantage of spontaneous Raman scattering spectroscopy is the small scattering cross-section of molecules that translates into long spectrum acquisition times, often preventing the analysis of e.g. low concentrated samples. With the advent of Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) micro-spectroscopy, it was possible to overcome this disadvantage: Now, the spectrum acquisition times could be reduced by up to three orders of magnitude. The challenge when interpreting coherent Raman scattering spectroscopy in a quantitative manner is the phase- retrieval and reconstruction of CARS spectra. The inability of conventional schemes to reconstruct the correct vibrational susceptibility of a molecular sample, as soon as it exhibits significant spectral overlap with its electronic susceptibility, posed a serious problem, preventing any quantitative statements regarding the sample. The development and application of such an analysis technique allowing a quantitative interpretation of the obtained CARS spectra is the central topic of this thesis. It will be demonstrated that when using fast CARS micro-spectroscopy the same information is obtained, as when spontaneous Raman scattering spectroscopy is used, even in cases where the vibrational and the electronic susceptibilities exhibit significant spectral overlap. The phase- retrieval will be performed using the maximum entropy method (MEM). When starting this thesis, the MEM- based calculation of the phase spectra required significantly more time than the acquisition of the CARS spectra. In this thesis, a new algorithm will be developed, allowing a reduction of the computational time by three orders of magnitude. Furthermore, light will be shed on exemplifying applications in the material and life sciences. The first application is the extraction of highly resolved 3D physical structure information of polymers within minutes using quantitative CARS micro-spectroscopy. Because such a measurement involves hundreds of thousands of spectra, this is not feasible using spontaneous Raman spectroscopy, which would take many hours. The second application uses multiplex CARS microscopy for the quantitative and noninvasive analysis of the chemical structures of biologically relevant lipids. In lipidomics research, the uptake and intracellular transport of low density lipoproteins (LDL) in human macrophages is of high interest. The noninvasive and fast determination of the chemical structures of biologically relevant lipids inside a living cell was however not possible using conventional fluorescence and mass spectroscopies. This will be directly demonstrated in living human macrophages by characterizing the spatial distribution of lipids, of their chain length, and of their degrees of acyl chain unsaturation on the single-cell and single-organelle levels by using quantitative CARS micro-spectroscopy developed in this thesis.

Unter denjenigen Spektroskopiemethoden, die sichtbares oder infrarotes Licht verwenden, bieten die molekularen Schwingungsspektroskopien, wie die spontane Raman-Spektroskopie, den großen Vorteil, dass sie keine Marker benötigen, und es somit gestatten, die Physik oder Chemie einer Probe betreffende Informationen ohne jegliche Probenpräparation zu ermitteln. Der Nachteil der spontanen Raman-Spektroskopie ist allerdings der geringe Streuquerschnitt der Probenmoleküle, der sich in lange Aufzeichnungsdauern für Spektren übersetzt, die es oft verhindern, bspw. niedrig konzentrierte Proben zu untersuchen. Mit dem Aufkommen der kohärenten anti-Stokes-Raman-Streuung (engl. Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS)) Mikrospektroskopie war es erstmals möglich, diesen Nachteil zu beseitigen: Nun konnte die Aufzeichnungsdauer von Spektren um bis zu drei Größenordnungen reduziert werden. Die Herausforderung bei der quantitativen Interpretation der CARS-Mikrospektroskopie besteht nunmehr in der Phasenrückgewinnung und Rekonstruktion von CARS-Spektren. Das Unvermögen der bisher anerkannten Methoden, die korrekte vibronische Antwort bei gegebener spektraler Überlappung mit der elektronischen Antwort eines Moleküls zu rekonstruieren, stellte ein schwerwiegendes Problem dar, in Folge dessen keinerlei quantitative Aussagen über die Probe getroffen werden konnte. Die Entwicklung und Anwendung einer Methode, die die quantitative Interpretation der erhaltenen Spektren erlaubt, ist zentraler Aspekt dieser Arbeit. Es wird dargelegt, dass selbst bei signifikanter spektraler Überlappung zwischen vibronischer Suszeptibilität und elektronischer Suszeptibilität bei Anwendung dieser neuen Technik CARS- und spontane Raman-Mikrospektroskopie denselben Informationsgehalt aufweisen. Zur Phasenrückgewinnung wird die Maximum-Entropie-Methode (MEM) verwendet. Bei Beginn dieser Arbeit veranschlagte die MEM-basierte Berechnung der Phasenspektren deutlich mehr Zeit als die Aufzeichnungsdauern der CARS-Spektren. In dieser Arbeit wird ein neuer Algorithmus entwickelt, welcher eine Reduktion des Rechenaufwands um drei Größenordnungen erlaubt. Darüber hinaus werden beispielhafte Anwendungen in den Material- und Lebenswissenschaften beleuchtet. Die erste Anwendung stellt die Gewinnung von hoch aufgelösten, 3D- Strukturinformationen von Polymeren binnen Minuten unter Verwendung der quantitativen CARS-Mikrospektroskopie dar. Da solche Messungen hunderttausende von Spektren beinhalten können, und somit bei Verwendung von spontaner Ramanspektroskopie viele Stunden Zeit in Anspruch nehmen würden, waren derartige Messungen bisher nicht praktikabel. Die zweite Anwendung verwendet CARS-Mikrospektroskopie zur quantitativen und nichtinvasiven Analyse der chemischen Struktur biologisch relevanter Lipide. In der Lipidomic-Forschung stellen die Aufnahme und der intrazelluläre Transport von Lipoproteinen niedriger Dichte (engl. low density Lipoprotein (LDL)) in menschlichen Makrophagen hochaktuelle Fragestellungen dar. Die nichtinvasive und schnelle Bestimmung der chemischen Struktur biologisch relevanter Lipide in lebenden Zellen war jedoch bisher nicht mittels koventioneller Fluoreszenz- und Massenspektroskopie möglich. Eine derartige Bestimmung von örtlichen Verteilungen solcher Lipide, ihrer Kettenlängen, sowie ihres Sättigungsgrades in lebenden menschlichen Makrophagenzellen wird sowohl von Einzelzellen-Niveau als auch auf Einzelorganellen-Niveau mittels der in dieser Arbeit entwickelten quantitativen CARS Mikrospektroskopie demonstriert.