Characterization and application of novel imine reductases

Abstract

Chiral amines are an ubiquitously distributed class of bioactive compounds, what turns them into preferred scaffolds for pharmaceuticals. The high chemical and enantiomerical purities required for such an application are ideally suited for biocatalysis as enzymatic methods routinely display high specificities. The established methods for chiral amine synthesis with lipases, ω-transaminases and amine oxidases, however have considerable limitations regarding their access to pharmaceutically relevant chiral secondary and tertiary amines. Recently the new enzyme class of imine reductases (IREDs) was described, offering an attractive extension to the currently used techniques as the preparation of imines by chemical methods in organic solvents is a well established and widely applicable method. As the number of IREDs known initially was limited to only three enzymes, this project started with a database search for the discovery of novel enzymes. For the first time it was shown that the IRED family is much larger than assumed and over 350 novel, putative IREDs were identified. A sequence analysis of the database members revealed (R)- type and (S)- type superfamilies and led after an update to the identification of IRED specific sequence motifs. These criteria allowed to define this new enzyme family on a sequence level and discriminate them from the closest related homologues. Based on the biochemical information about the three published IREDs and a conservation analysis of the database members, three new enzymes from Streptosporangium roseum DSM43021, Streptomyces turgidiscabies and Paenibacillus elgii were selected for characterization. The enzymes were shown to encode for functional IREDs with much higher activity than the previously known IREDs. By site directed mutagenesis the mechanism of the IREDs was probed and the importance of a conserved Tyr for catalysis of an (S)- type IRED shown, while the crucial role of the proposed Asp residue for catalysis in the (R)- type IREDs was questioned. The characterization of the new IREDs revealed their pH optima and confirmed the suspected dimerization. The thermostability of the IREDs was investigated and the selected (S)- type IRED identified as the most stable enzyme known to date. Further the activity in the presence of water miscible organic solvents was tested and high tolerance versus MeOH found. In biotransformations all IREDs showed high activity and a broad panel of cyclic imines was fully converted to piperidines and tetrahydroisoquinolines with enantioselectivities up to 99% ee. With purified IREDs kinetic constants for these substrates were recorded and their substrate preference investigated. This indicated a preference of the (S)- type IRED for more bulky substrates, compared to the (R)- type IREDs. After optimization of the reaction conditions, with purified IREDs also high activities and chemo- as well as enantioselectivities for very labile exocyclic imines were detected. The possibility to effectively reduce already low levels of such imines led to the application of one (R)- type IRED for the generation of novel C-N bonds by reductive aminations. The established methodology revealed the crucial influence, conditions that favor imine formation (high molar excess of the amine nucleophile and high pH) display on the conversion rates. Under optimized conditions, different carbonyls could efficiently be transformed with a variety of amines in the aqueous buffer system with moderate to good conversions into primary and secondary (chiral) amines with very high selectivities (ee up to 98%). Finally, an application of IREDs in cascade reactions to produce saturated N-heterocyclic compounds was envisioned. A microbial putrescine oxidase (PuO) was chosen to selectively oxidize polyamines to aminoaldehydes, thereby triggering their spontaneous cyclization to an imine. To target a broad range of heterocycles, PuO was characterized with a range of unnatural polyamines. The results indicated a narrow substrate scope and low activity for these compounds. To enhance the activity for such substrates directed evolution of PuO with epPCR was performed and led to the identification of a Glu residue, representing a hotspot for mutagenesis. This residue aligns to one of the multiple channels that lead into the deeply buried active site of PuO and it is located in the second shell around the active site. By site-saturation mutagenesis further mutants in the active site and this channel were generated and many mutants with smaller amino acids demonstrated the influence of this hotspot position to increase the activity of the enzyme. The best mutant exhibited considerably increased activities (up to 25-fold) for unnatural polyamines and also for natural polyamines the substrate spectrum was strongly shifted from putrescine towards longer polyamines like spermidine which is now transformed with a 10-fold increased catalytic efficiency (kcat/KM). The combination of both enzymes in purified form as well as in whole cells enabled the production of heterocyclic amines relying on the consecutive transformation of the substrate by both enzymes. While with the whole cell system only low amounts of the N-heterocyclic compounds were produced, the utilization of purified enzymes led in case of all three IREDs to high conversions of different polyamines into pyrrolines and piperidines.

Chirale Amine stellen eine allgegenwärtige Klasse an bioaktiven Verbindungen dar, weshalb sie auch bevorzugte Leitstrukturen für Pharmazeutika ausmachen. Die sehr hohen chemischen- und enantiomeren Reinheiten die für einen solchen Einsatz erforderlich sind, stellen ideale Vorrausetzungen für biokatalytische Herstellungsmethoden dar, da enzymatische Methoden oft hohe Spezifitäten aufweisen. Jedoch besitzen die derzeit etablierten Methoden die zur Synthese chiraler Amine eingesetzt werden können und auf Lipasen, ω-Transaminasen und Aminoxidasen basieren, beträchtliche Limitierungen was ihren Einsatz zur Darstellung pharmazeutisch relevanter chiraler sekundärer und tertiärer Amine betrifft. Kürzlich wurde mit den Iminreduktasen (IREDs) eine neue Enzymklasse beschrieben die eine attraktive Erweiterung zu den derzeit verwendeten Biokatalysatoren darstellt, da die chemische Synthese von Iminen in organischen Lösemitteln eine etablierte und breit anwendbare Methode repräsentiert. Da die Anzahl bekannter IREDs mit nur drei beschriebenen Enzymen zunächst sehr gering war, startete dieses Projekt mit einer Datenbankanalyse zur Entdeckung neuer Enzyme. Zum ersten Mal wurde hierbei gezeigt, dass die IRED Familie wesentlich größer ist als angenommen und über 350 neue, putative IREDs wurden identifiziert. Über eine Sequenzanalyse wurden die Datenbankvertreter in (R)- Typ und (S)- Typ Familien eingeteilt und nach einem Datenbankupdate wurden IRED spezifische Sequenzmotive identifiziert. Diese Kriterien ermöglichten die Definition von IREDs auf Sequenzebene und ihre Unterscheidung von den nächstverwandten Enzymen. Basierend auf publizierten biochemischen Daten der drei bekannten Enzyme und einer Konservierungsanalyse der Datenbankvertreter wurden drei neue Enzyme aus Streptosporangium roseum DSM43021, Streptomyces turgidiscabies und Paenibacillus elgii zur Charakterisierung ausgewählt. Es wurde gezeigt, dass diese Sequenzen für funktionale IREDs kodieren welche wesentlich höhere Aktivitäten besitzen als die bisher bekannten IREDs. Über ortsgerichtete Mutagenese wurde der Mechanismus der IREDs untersucht und der Einfluss eines konservierten Tyr auf die Aktivität der (S)- Typ IRED gezeigt, während gleichzeitig die essentielle Rolle des Asp Restes, welcher für die (R)- Typ IREDs als katalytisch wichtig vorgeschlagen wurde, hinterfragt wurde. Zur Charakterisierung der drei IREDs wurden deren pH Optima untersucht und die vermutete Dimerisierung bestätigt. Die Thermostabilität wurde untersucht und die ausgewählte (S)- Typ IRED als die stabilste der derzeit bekannten IREDs ausgemacht. Weiterhin wurde die Aktivität der IREDs in Gegenwart Wasser mischbarer organischer Lösemittel untersucht und eine hohe Toleranz gegenüber MeOH festgestellt. In Biotransformationen zeigten alle IREDs hohe Aktivitäten und eine breite Auswahl an zyklischen Iminen wurde vollständig umgesetzt und sowohl Piperidine als auch Tetrahydroisochinoline wurden mit sehr hohen Enantioselektivitäten von bis zu 99% ee erhalten. Mit den aufgereinigten IREDs wurden die kinetischen Konstanten für diese Substrate bestimmt und die Substratpräferenz der IREDs untersucht. Dies deutete auf ein breiteres Substratspektrum der (S)- Typ IRED hinsichtlich sperriger Substrate hin im Vergleich zu den (R)- Typ IREDs. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen mit aufgereinigten IREDs wurden zudem hohe Aktivitäten und sowohl Chemo- als auch Enantioselektivitäten für den Umsatz von sehr labilen exozyklischen Iminen gezeigt. Die Möglichkeit auch sehr geringe Mengen solcher Imine effektiv umsetzen zu können führte zur Anwendung einer (R)- Typ IRED für die Generierung neuer Kohlenstoff-Stickstoff Bindungen durch reduktive Aminierung. Die entwickelte Methodik enthüllte den elementaren Einfluss welchen Reaktionsbedingungen die die Iminbildung begünstigen (hoher molarer Überschuss an Aminnukleophil und hohe pH Werte) auf die Umsatzraten besitzen. Unter optimierten Bedingungen konnte die effiziente Umsetzung verschiedener Carbonyle mit einer Auswahl an unterschiedlichen Aminen im wässrigen Puffersystem mit moderaten bis guten Umsetzungen und sehr hohen Selektivitäten (bis zu 98% ee) in primäre und sekundäre (chirale) Amine gezeigt werden. Des Weiteren wurde eine Anwendung der IREDs in Kaskadenreaktionen untersucht, die die Produktion von gesättigten, stickstoffhaltigen Heterozyklen ermöglicht. Eine mikrobielle Putrescinoxidase (PuO) wurde für die selektive Oxidation von Polyaminen zu Aminoaldehyden ausgewählt um deren spontane Zyklisierung zu einem Imin zu induzieren. Um dies auf ein breites Spektrum an Heterozyklen anwenden zu können, wurde die Aktivität der PuO mit einer Auswahl an nicht-natürlichen Polyaminen untersucht. Die Ergebnisse deuteten auf ein beschränktes Substratspektrum mit geringen Aktivitäten für diese Verbindungen hin. Zur Verbesserung der Aktivitäten für solche Substrate, wurde durch gerichtete Evolution über epPCR ein Glu Aminosäurerest identifiziert, welcher ein Hotspot für die Mutagenese darstellt. Die Seitenkette dieser Aminosäure befindet sich in einem der zahlreichen Kanäle die in die tief im Inneren des Enzyms liegende aktive Tasche führen, zudem befindet sich diese Aminosäure in der sogenannten zweiten Schale um das aktive Zentrum. Über ortsgerichtete Sättigungsmutagenese wurden weitere Mutanten im aktiven Zentrum des Enzyms und in diesem Kanal generiert; hierbei verdeutlichten mehrere Mutanten mit kleinere Aminosäureseitenketten den Einfluss der Hotspot Position darauf, die Aktivität des Enzyms zu erhöhen. Die beste Mutante wies beträchtlich gestiegene Aktivitäten (bis zu einer 25-fachen Erhöhung) für nicht-natürliche Polyamine auf und zeigte auch für natürliche Polyaminsubstrate eine starke Veränderung im Substratspektrum des Enzyms von Putrescin hin zu längeren Polyaminen wie Spermidin, die jetzt mit einer über 10-fach höheren katalytischen Effizienz (kcat/KM) umgesetzt wurden. Die Kombination aus beiden Enzymen sowohl in aufgereinigter Form, als auch in ganzen Zellen ermöglichte dann die Produktion von heterozyklischen Aminen welche auf die aufeinanderfolgende Transformation des Substrates durch beide Enzyme angewiesen war. Während mit dem Ganzzellsystem nur geringe Mengen der stickstoffhaltigen Heterozyklen gebildet wurden, resultierte die Verwendung von aufgereinigten Enzymen im Fall aller drei IREDs in hohen Umsätzen von verschiedenen Polyaminen zu Pyrrolinen und Piperidinen.