03 Fakultät Chemie

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Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für BiochemieEnd date: 2009

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    Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum : Identifizierung und Charakterisierung von Komponenten des Abbaus missgefalteter sekretorischer Proteine
    (2003) Hitt, Reiner; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
    Das endoplasmatische Retikulum (ER), der Faltungsort von Proteinen des sekretorischen Systems, besitzt ein komplexes Netzwerk faltungsunterstützender und kontrollierender Proteine. Sekretorische Proteine, die ihre endgültige räumliche Konformation jedoch nicht erlangen, werden dem Ubiquitin-Proteasom-System zum Abbau zugeführt. Dieser Prozess wird im Allgemeinen mit ER-Degradation oder ER-assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden drei zur endoplasmatischen Proteinqualitätskontrolle gehörende Themengebiete bearbeitet: Als erstes wurde die Klonierung des bisher unbekannten DER7 Gens mit Hilfe der isolierten ERAD Mutante der7-1 durchgeführt. Danach erfolgte eine weitergehende Charakterisierung des Der1 Proteins und der Vergleich mit den Der1-Homologen Ydr411c (S. cerevisiae) und R151.6 (C. elegans). Zuletzt wurde der Einfluss einiger zytosolischer Chaperone auf den Abbau des ERAD Modellsubstrats CPY* untersucht. Die bisher nicht charakterisierte ERAD Mutante der7-1 bewirkt einen verlangsamten Abbau der ERAD Substratproteine CPY* und PrA*. Zusätzlich ist die Beweglichkeit dieser Proteine im elektrischen Feld verringert. Es konnte gezeigt werden, dass dies auf eine defekte Prozessierung der N-Glykoside im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen ist. Durch Kreuzen des der7-1 Allels mit Nullmutanten von Glukosidase I und II, durch Komplementation mit plasmidkodierter Glukosidase I und durch meiotische Kartierung wurde gefunden, dass DER7 mit CWH41 identisch ist. CWH41 kodiert für das Enzym Glukosidase I, welches bei der Prozessierung der Oligosaccharide im endoplasmatischen Retikulum einen terminalen alpha1,2-Glukoserest entfernt. Korrekt getrimmte Oligosaccharide scheinen daher für eine effiziente Proteindegradation notwendig zu sein. Das bestätigt sich durch den, für Doppelmutanten des ERAD und der „unfolded protein response“ (UPR) typischen, temperaturabhängigen Wachstumsdefekt von der7-1 deltaire1 Mutanten. Das Protein Der1 wurde schon in früheren Arbeiten als eine Komponente der ERAD-Maschinerie identifiziert. Bisher wurde jedoch eine Beteiligung nur am Abbau einiger löslicher missgefalteter Proteine nachgewiesen. Durch den Vergleich des Der1 abhängigen Abbaus von löslicher CPY* und membranständigem CTG* (CPY*-Transmembrandomäne-GFP) konnte nun gezeigt werden, dass die Funktion von Der1 unabhängig von der Missfaltung ist und sich wahrscheinlich auf die Degradation löslicher Proteine beschränkt. Eine topologische Charakterisierung von Der1 zeigte, dass der N- und der C-Terminus im Zytosol lokalisiert sind und Der1 insgesamt vier Transmembrandomänen besitzt. Es wurde außerdem gefunden, dass Der1 sehr empfindlich auf Veränderungen am Protein reagiert. Einzig kleinere Modifikationen des C-Terminus, wie das Einfügen eines einzelnen HA-Epitops oder einer N-Glykosylierungs-Konsensussequenz, erhalten die Funktionalität des Proteins. Um potentielle Interaktionspartner von Der1 zu finden, wurde nach High-Copy-Suppressoren der Temperatursensitivität von der1-2 deltaire1 Doppelmutanten gesucht. Es wurden 19 Genbankplasmide erhalten, die im Genbankinsert weder DER1 noch IRE1 enthielten. Ihre Wirkungsweise ist jedoch möglicherweise indirekt, da der Abbau von CPY* durch ihre Expression in der1-2 Mutanten nicht wiederhergestellt wurde. Die fortschreitende Genomsequenzierung ermöglichte inzwischen die Identifizierung einer „Der1-ähnlichen“ Familie mit mehr als 15 Vertretern aus den unterschiedlichsten Organismen. Zwei dieser homologen Proteine sind Ydr411c aus S. cerevisiae und R151.6 aus C. elegans. Das Der1 homologe Protein Ydr411c wurde wegen seiner Zugehörigkeit zur „Der1-ähnlichen“ Familie Dfm1 (Der1-like family member) benannt. Ebenso wie Der1, besitzt Dfm1 einen zytosolischen C-Terminus und ist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Im Gegensatz zur deltader1 deltaire1 Doppelmutation, führt die deltadfm1 deltaire1 Doppeldeletion jedoch nicht zu temperatursensitiven Hefestämmen. Des Weiteren konnte nur ein äußerst schwacher Einfluss von Dfm1 auf den Abbau des ERAD Substrats CPY* festgestellt werden. Das C. elegans Protein R151.6 hingegen, scheint dieselbe Funktion wie Der1 der Hefe auszuüben. Seine heterologe Expression in deltader1 deltaire1 Doppelmutanten hob die konditionale Letalität dieses Stamms auf. Das deutet darauf hin, dass die Funktion von Der1 auch in höheren Organismen konserviert ist. Als weiteres stellte sich die Frage ob die zytosolischen Chaperone der Hsp90 und Hsp100/Clp am Abbau löslicher ERAD Substrate beteiligt sind. Die in dieser Arbeit getesteten deltahsc82, deltahsp82, deltasti1, deltasba1 und deltahsp104 Nullmutanten zeigten jedoch keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit von CPY*. Ob zytosolische Chaperone generell nur beim Abbau von Membransubstraten eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
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    The active subunits of the 20S Proteasome in Saccharomyces cerevisiae : mutational analysis of their specificities and a C-terminal extention
    (2008) Estiveira, Rui José Cabrita; Heinemeyer, Wolfgang (PD Dr.)
    The proteasome is a large multi-subunit complex ubiquitous in eukaryotes and archaebacteria. It contains proteolytic subunits that function simultaneously to digest protein substrates into oligopeptides. In eukaryotic cells, it is involved in the removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, but additionally it has regulatory functions. For example it is responsible for the degradation of cyclins in cell-cycle control and for the destruction of transcription factors or metabolic enzymes in metabolic adaptation. Finally, the proteasome is also involved in MHC (major histocompatibility complex) class I mediated cellular immune response. These cellular functions are linked to an ubiquitin- and ATPrequiring protein degradation pathway involving the 26S proteasome whose proteolytic core is formed by the 20S proteasome. The 20S proteasome has a cylindrical shape and is composed of four rings, each formed by seven α- or seven β-subunits and stacked in the order αββα. In eukaryotic cells, the 20S proteasome is composed of two copies of 14 different subunits, 7 distinct α-type and 7 distinct β-type subunits. Only three of the β-type subunits are proteolytically active and have N-terminal threonine residues acting as nucleophiles. They differ in their major specificities: β5/Pre2, β2/Pup1 and β1/Pre3 are classified as having "chymotrypsin-like", "trypsin-like" and "peptidylglutamyl peptide hydrolysing" (PGPH or caspase-like) activities, respectively. This classification is based on the preferred amino acid residues found at the site of hydrolysis in peptide or protein substrates. These three active β-type subunits have a fixed location in the proteasome, with the two β5/Pre2 copies separated from the clustered β2/Pup1 and β1/Pre3 subunits. In yeast a hierarchy of individual subunit activities for proteasomal function was established: β5/Pre2>> β2/Pup1 > β1/Pre3. Part of this work aimed at clarifying whether this hierarchy is solely dependent on the specificities or whether topological conditions lead to the dominance of the β5/Pre2 activity over the others, which could involve inter-subunit communication mediated by interjacent inactive β-subunits. Stepwise site-directed mutagenesis of key residues forming the substrate binding pockets was used to swap specificities between the yeast β5/Pre2 and β1/Pre3 active sites. Consequences of these mutations were then analysed in regard to maturation of the modified subunits, their specificities towards peptide substrates diagnostic for chymotrypsin-like and PGPH activity and changes in their rank in the hierarchy of functional importance. By mutating the key residue methionine 45 into an arginine, the β5/Pre2 was able to mature and showed some PGPH activity. Combinations with mutant strains, having the other active subunits inactivated, revealed that Pre2 lost its functional dominance. When other key residues were additionally replaced by those present in β1/Pre3 (A20T, V31T, I35T), instead of an further increase in PGPH activity, the β5/Pre2 subunit showed an overall decrease in activity. An unexpected exception was the pre2-M45R-I35T mutant with a strong increase in chymotrypsin-like activity. Maturation of the Pre2 subunit occurred normally like in wild-type in all combinations of mutations tested. When the residue arginine 45 was mutated into a methionine in Pre3, this subunit lost any detectable peptidase activity. Attempts to stabilise the methionine 45 by introducing strategic point mutations at residue 52 were unsuccessful. Additional alterations in the substrate binding site of β1/Pre3 (T20A, T31V, T35I) completely abolished the autolytic maturation and thus any gain of activity. Strains lacking both the Pre3 propeptide and Nα-acetyltransferase were used to confirm that the mutations result in activity loss, even when the autolytic removal of the propeptide was not required. In a second project, the role of the long C-terminal extension of the yeast β2/Pup1 subunit was examined. This 37 amino acid structure embraces the β-ring neighbor subunit β3/Pup3 and reaches the next subunit β4/Pre1. It also contacts β7/Pre6 of the opposite β-ring. Mutations of residues that could loosen contact to the surface of β3/Pup3 (Y204A, R208G and T211A) where without effect. Complete deletion of this extension or truncation of 25 residues was lethal and deletion of the last 20 amino acids caused a strong cell growth defect. When replacing the last 20 amino acids of this C-terminal extension by a FLAG tag, the growth phenotype was lost. The lethal mutations were over-expressed in wild type strains, but the mutated β2 subunits did not incorporate into proteasomes. This indicates that removal of the distal half from the β2/Pup1 C-terminal extension impedes the integration of this subunit during early assembly stages of the 20S proteasome.
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    Characterization of novel proteins involved in catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in saccharomyces cerevisiae
    (2006) Pfirrmann, Thorsten; Wolf, Dieter (Prof. Dr.)
    Glycolysis and gluconeogenesis are reciprocally controlled central metabolic pathways in cells. Catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) is a key regulatory step, when Saccharomyces cerevisiae cells switch from anabolic gluconeogenesis to catabolic glycolysis. Addition of glucose to cells growing on a non-fermentable carbon source causes FBPase phosphorylation resulting in a decrease of enzymatic activity. This is followed by a proteolytic breakdown of the enzyme via the ubiquitin-proteasome system with a half-life of 20-30 min. In a genome wide screen nine so called gid mutants (glucose induced degradation deficient) defective in proteasome-dependent catabolite degradation of FBPase were identified. Analysis of Gid2 revealed that this protein is a part of a soluble, cytosolic protein complex with a molecular mass of at least 600kDa (Regelmann et al., 2003). The work of this thesis focuses on the analysis of the novel Gid proteins and their possible role in a higher molecular mass protein complex. To be able to detect Gid proteins immunologically, functional chromosomally HA eptitope tagged versions of Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 proteins were generated. Using step glycerol gradient centrifugation it could be shown that Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 are also components of a higher molecular mass complex of about 600kDa. Gid1/Vid30, Gid/Ubc8 and Gid4/Vid24 exhibit a sedimentation profile of lower molecular mass slightly overlapping with 600kDa aminopeptidase I. Gid6/Ubp14 is only present in its monomeric form. Use of Gid7 as a bait protein in a co-immunoprecipitation experiment, led to the identification of Gid1/Vid30, Gid2, Gid4/Vid24, Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 as interacting components. The protein Gid6/Ubp14 is not part of this protein complex. The direct interaction of Gid4 with Gid5 could be shown via the two hybrid method. Expression profiles on ethanol or glucose of Gid1, Gid2, Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 were similar. Gid4/Vid24 was not expressed on ethanol but appears when cells are treated with glucose. As found for Gid3/Ubc8 (Schüle et al., 2000), Gid4/Vid24 seems to disappear during incubation on glucose in a time-dependent fashion. Fructose-1,6-bisphosphatase was found to interact with Gid1 and Gid7 protein. As shown for GID2 (Regelmann et al., 2003) deletion of GID1 and GID7 leads to a block in fructose-1,6-bisphosphatase polyubiquitination. This shows that Gid proteins are directly involved in the ubiquitination process which preceeds proteasome degradation. Two discovered short RING domains in Gid2 and Gid9 (ShRING domains) as well as the discovery of 5 WD40 domains within Gid7 suggest a role of the Gid complex as a novel E3 ubiquitin ligase. The targeted mutation of conserved cysteine residues within the shRING domain of Gid2 could support this theory. Biochemical and molecular methods were used to identify the localization of Gid1, Gid6, Gid7 and Gid8. Interestingly all four Gid proteins were found to be localized in the nucleus. The direct interaction of FBPase with these Gid proteins raised the question of whether FBPase itself had a function in the nucleus of the cell or not. To investigate this question GFP-fusions with FBPase were constructed and localisation studies were performed. An increasing signal of FBPase within the nucleus after onset of catabolite degradation gave proof of the existence of this enzyme in the nucleus as well. Several mutants known to have a defect in nuclear import were tested for the catabolite degradation of FBPase. The protein kinaseA pathway was shown to be the signal transduction pathway triggering FBPase degradation. This led to the discovery of novel putative phosphorylation sites within FBPase by bioinformatics.
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    Untersuchungen zur Expression, Funktion und Regulation der ABC-Transporter P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 beim Menschen
    (2003) Hitzl, Monika; Wolf Dieter H. (Prof. Dr.)
    Das Ausmaß der Wirkung eines Arzneimittels hängt von seiner Konzentration am Wirkort ab. Zu niedrige Konzentrationen des Wirkstoffes haben keinen erwünschten therapeutischen Effekt beim Patienten. Im Gegensatz dazu bewirken zu hohe Arzneimittelkonzentrationen häufig toxische Nebenwirkungen. Arzneimitteltransporterproteine sind neben Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen für die Pharmakakonzentration am Wirkort verantwortlich. Das Verständnis der Ursachen interindividueller Unterschiede in der Expression solcher Transporterproteine kann somit dazu beitragen, interindividuelle Unterschiede in der Arzneimittelwirkung zu verstehen. In dieser Arbeit wurden zwei ATP-binding cassette Transporterproteine, P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Polymorphismus in Exon 26 des humanen MDR1-Gens (C3435T) mit einer reduzierten P-Glykoproteinexpression und -funktion assoziiert ist. Träger dieses Polymorphismus (3435 TT) zeigten eine niedrigere P-Glykoproteinexpression in Leukozyten als Probanden mit dem CC-Genotyp. Zur Ermittlung der P-Glykoproteinfunktion wurde der Efflux des P-Glykoproteinsubstrates Rhodamin123 aus Leukozyten mit der höchsten P-Glykoproteinexpression (CD56+ NK-Zellen) gemessen. Die P-Glykoproteinfunktion in CD56+ NK-Zellen von Individuen mit dem Genotyp 3435 TT in Exon 26 des MDR1-Gens war signifikant niedriger als bei Individuen mit dem CC-Genotyp. Die Abhängigkeit der P-Glykoproteinexpression vom MDR1-Genotyp wurde auch in Plazenta- und Kolongewebe untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die P-Glykoproteinexpression in humanem Plazentagewebe durch den Polymorphismus C3435T in ähnlicher Weise wie in den CD56+ NK-Zellen beeinflusst wurde. In Fällen, in denen Mutter und Kind den gleichen Genotyp hatten, führte die Mutation in Exon 26 des MDR1-Gens (3435 TT) zu einer 40 %igen Reduktion der P-Glykoproteinexpression in Plazentagewebe. Diese Befunde bedeuten, dass Arzneimittel, welche P-Glykoproteinsubstrate sind (z. B. HIV-Proteaseinhibitoren), niedrigere Konzentrationen in den Leukozyten von Individuen mit dem Genotyp 3435 CC erreichen und somit möglicherweise eine geringere Wirksamkeit haben (z. B. bei HIV). Eine genetisch-bedingte, niedrigere P-Glykoproteinexpression in der Plazenta dürfte die Anreicherung von Xenobiotika im Feten verstärken und könnte somit ein erhöhtes Teratogenitätsrisiko darstellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation von Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Eine Analyse von 62 humanen Lebern zeigte eine erhebliche Variabilität der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression. Der Protonenpumpenhemmer Omeprazol wurde als Faktor identifiziert, der zu einer signifikanten Erhöhung der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression im Lebergewebe von Patienten führt. Durch in vitro Experimente konnte die Induktion des Multidrug Resistance Proteins 3 durch Omeprazol bestätigt werden. Weitere Experimente zeigten, dass der Aryl Hydrokarbon Rezeptor am Mechanismus der Induktion von Multidrug Resistance Protein 3 durch Omeprazol beteiligt ist. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass Gallensäuren die Expression von Multidrug Resistance Protein 3 in CaCo-2 Zellen induzieren. Da die Expression von ABC-Transporterproteinen häufig in Tumorgewebe induziert ist und somit zur Multidrug Resistance bei der Chemotherapie beiträgt, wurde die MRP3-Expression in Kolon-Tumorgewebe untersucht. Es konnte jedoch bei diesem Tumor eine niedrigere MRP3-Expression im Vergleich zu gesundem Kolongewebe nachgewiesen werden. Mit dieser Arbeit wurden Faktoren identifiziert, die zu einer variablen Transporterprotein-expression beitragen. Das bessere Verstehen dieser Einflussfaktoren könnte somit einen Beitrag zu einer individualisierten, sichereren Arzneimitteltherapie leisten.
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    Die HECT-Ligase Hul5, eine neue Komponente der ER-assoziierten Proteindegradation
    (2007) Kohlmann, Sonja; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
    Die meisten sekretorischen Proteine der eukaryontischen Zellen erreichen durch das endoplasmatische Retikulum (ER) den sekretorischen Signalweg. Sie gelangen vom Zytoplasma durch einen Kanal in der ER-Membran in das ER, wo sie ihre native Konformation erhalten. Das ER enthält ein strenges Qualitätskontrollsystem, welches fehlgefaltete Proteine erkennt, im ER zurückhält und letztendlich der ER-assoziierten Degradation (ERAD) zuführt. Die ER-Qualitätskontrolle und die ER-assoziierte Degradation sind eng miteinander verknüpft, und werden unter der Bezeichnung ER-Qualitätskontrolle und assoziierte Degradation (ERQD) zusammengefasst. Die ERQD ist von der Hefe bis hin zum Menschen ein hoch konservierter Prozess. Aus diesem Grund wird die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus zur Erforschung solcher sogenannter „housekeeping“ Prozesse genutzt. In dieser Arbeit wurden durch einen genomweiten Screen neue Komponenten der ER-assoziierten Degradation identifiziert. Für diesen Screen wurden die EUROSCARF Hefe-Deletionsbank und das Screeningsubstrat Sec61-2L verwendet. Die Deletionsbank besteht aus etwa 5000 diploiden S. cerevisiae Stämmen mit je einer homozygoten Einfachdeletion. Bei dem Screeningsubstrat Sec61-2L handelt es sich um das nicht glykosylierte, mutierte Translokonprotein Sec61-2 und einer C-terminalen zytosolischen Fusion mit der 3-Isopropylmalat-Dehydrogenase (Leu2). Das für Sec61-2L kodierende Plasmid wurde in die leu2-auxotrophen Deletionsstämme transformiert und der Wachstumsphänotyp bei 38° auf Leucin-defizientem Medium getestet. Aufgrund der Punktmutation faltet sich Sec61-2 bei 38°C in einer Art und Weise, dass es der ER-Degradation unterliegt. Nur wenn Sec61-2L stabil vorliegt, also in Deletionsstämmen mit einem Defekt in der Erkennung oder der Degradation des fehlgefalteten Sec61-2L, ist ein Wachstum auf Leucin-defizientem Medium möglich. Auf diese Weise konnten über 40 bisher unbekannte, potentielle Komponenten der ER-Qualitätskontrolle und ER-assoziierten Degradation identifiziert werden. Unter anderem wurde durch diesen genomischen Screen die E4-Ligase Hul5 als Komponente des ERAD für dieses nicht glykosylierte Substrat gefunden. Des Weiteren war bereits durch einen entsprechenden Screen mit dem Substrat CTL* bekannt, dass Hul5 auch am Abbau dieses glykosylierten ERAD-Substrats beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass für den vollständigen Abbau der ERAD-Substrate Sec61-2Lmyc und CTL*myc die katalytische Funktion der E4-Ligase Hul5 benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass der Abbau der Substrate Sec61-2Lmyc und CTL*myc im Wildtypstamm sowie in der HUL5 Deletionsmutante am N-Terminus einsetzt und über definierte Zwischenprodukte verläuft. Im Wildtypstamm kann auf diese Weise der Abbau der Substrate vollständig verlaufen. Im Gegensatz dazu erfolgt in der HUL5 Deletionsmutante ein Abbruch der Degradation am Proteasom, was zu einer Akkumulation der C-terminalen Abbaufragmente truncSec61-2Lmyc und truncCTL*myc führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass für den Abbau des N-terminalen Anteils von CTL*myc keine Extraktion des Proteins aus der ER-Membran notwendig ist. Demzufolge muß der N-Terminus von CTL*myc durch die ER-Membran in das Zytosol der Zelle ragen, wo die Ubiquitinierung und die Degradation des Substrats einsetzen. Außerdem wurde gefunden, dass auch das Proteasom an der Extraktion von CTL*myc aus dem ER beteiligt ist. Es ist bekannt, dass die E4-Ligase Hul5 gemeinsam mit dem deubiquitinierenden Enzym Ubp6 und dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc4 den Abbau anderer proteasomaler Substrate regulieren kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Degradation des ERAD-Substrats CTL*myc durch Hul5, jedoch nicht durch Ubp6 und Ubc4 beeinflusst wird. Dieses Ergebnis gibt Hinweise auf weitere mit Hul5 agierende deubiquitinierende und Ubiquitin-konjugierende Enzyme.
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    The novel proteasomal substrate Far10 contributes to control of mitotic exit in yeast
    (2005) Karnam, Harish Kumar; Hilt, Wolfgang (Priv. Doz. Dr. )
    Ubiquitin-Proteasome System (UPS) mediated proteolysis of an array of cellular proteins plays an important role in many basic physiological processes. Among these are control of cell cycle and division, differentiation and development, response to stress, transcriptional regulation, circadian rhythms, regulation of the immune and inflammatory responses, and biogenesis of organelles. Some of the well-known substrates of this system are cell cycle regulators such as cyclins, cyclin dependent kinase inhibitors, and proteins involved in sister chromatid separation, tumor suppressors, as well as transcriptional activators and their inhibitors [Glickman, 2002; Hilt, 2004; Wolf, D.H, 2004]. Due to these facts, identification and characterization of new substrates of the ubiquitin-proteasome system is important to reveal its cellular functions. For this purpose a high expression lethality [HEL] screen had been developed [Ledig, 1996; Velten, 1996, Velten, 2000]. This screen was based on the hypothesis that overexpression of a protein whose degradation by the ubiquitin-proteasome system is required for viability or growth, will cause a strong growth defect in cells where proteasome function is impaired, as for instance in pre1-1 pre4-1 mutants. An unknown protein originally designated as Hel48 now commonly termed as Far10 was identified, [Velten, 2000; Kemp and Sprague, Jr., 2003]. In this work cycloheximide chase experiments were undertaken to prove that Far10 is a novel substrate of the proteasome. Far10 expressed from its endogenous promoter on the chromosome either as N-terminally 19Myc tagged or as C-terminally 3Ha-tagged version was rapidly degraded in wild type cells and stabilized in pre1-1 pre4-1 proteosome mutants. Based on the ability of HA-tagged Far10 to cause lethality it was concluded that the tagged version of this protein is functional. Therefore the degradation rates seen with different tagged versions are supposed to be as wild type. The identical behavior of N-terminally and C-terminally tagged Far10 strongly support this idea. Regulatory proteolysis is an important mechanism for major cell cycle transitions such as the initiation of DNA replication, separation of sister chromatids and exit from mitosis [Jan-Michael Peters, 1998; Hilt, 2004]. APC, an ubiquitin-protein ligase, consisting of 12 known subunits in Saccharomyces cerevisiae is essential for ubiquitin-dependent proteolysis during mitosis [Harper et al., 2002; Jan-Michael Peters, 2002]. It requires two substrate specific co-activators: Cdc20 and Cdh1/Hct1. Substrates of APCCdc20 complex include non-cyclins such as Pds1 [Cohen-Fix et al., 1996; Michaelis et al., 1997; Ciosk et al., 1998; Nasmyth, 1999] and cyclins such as Clb2 and Clb5 [Bäumer et al., 2000; Wäsch, 2002; Irniger, 2002; Cross, 2003]. APCCdh1 complex initiates degradation of the mitotic cyclin Clb2 in telophase and also mediates proteolysis of other proteins such as the spindle-associated protein Ase1, Cdc20 and the polo-like kinase Cdc5 [Schwab et al., 1997; Visintin et al., 1997; Shirayama et al, 1998]. Thus, Cdc20 and Cdh1 ensure that different target proteins of the APC are degraded in a proper temporal order during mitosis. The participation of the anaphase-promoting complex and its co-activators in the degradation of Far10 was demonstrated by the observation of synthetic dosage effects in cdc23-1, cdc20-1 and hct1-?1 mutants. Cycloheximide decay analysis of 19Myc tagged Far10 in cdc23-1 APC mutants as well as cdc20-1 and proteasome mutants uncovered a clear proteolytic stabilization of N(myc)19Far10. On the contrary, a deletion of HCT1 had no effect on the degradation of Far10. These results confirm that Far10 is a genuine substrate of the APC and requires the specificity factor Cdc20 for its degradation. In addition to this, analysis of in-vivo ubiquitination experiments of Far10(HA)3 in wild type (WCG4) and pre1-1 pre4-1 proteasome mutants revealed that the polyubiquitinated forms of Far10(HA)3 accumulate in the pre1-1 pre4-1 proteasome mutants. Substrates of APC and Cdc20 in particular identified till date have a nine amino acid conserved motif called the destruction [D] box which has a consensus sequence: RXXLXXVXN/D/E. Far10 being a substrate of APCCdc20 has a nine amino-acid sequence similar to the D box motif, 340RRKLSGKYE348 residing in the C-terminal region. To check the relevance of this motif in the degradation of Far10, site directed mutagenesis of 1) first two arginines (340, 341) to alanine and leucine and 2) leucine (343) to alanine was carried out. Overexpression of these two different mutant versions of Far10 in the wild type yeast strains did not result in toxicity. Moreover, cycloheximide chase analyses of N(Myc)19Far10(L343A) expressed from the endogenous promoter on the chromosome showed that this mutant protein was not stabilized in wild type yeast strains. These data suggest that this sequence in Far10 may not confirm to a classical D-box and that the degradation signals might be located else where in the protein. It could also be possible that mutations in this D-box have to be collective in order for the desired effect(s) to be seen. Database analysis of FAR10 revealed an N-terminal FHA (fork head associated) domain and a C-terminal transmembrane domain. Cell fractionation experiments as well as immunofluorescence studies proved that Far10 localizes to the nuclear envelope [Velten, 2000]. To investigate the function of the C-terminal transmembrane domain, a deletion construct containing Far10 lacking the transmembrane domain, far10?TM was generated. In contrast to wild type Far10 this mutant protein was unable to cause synthetic dosage effects in pre1-1 pre4-1, cdc23-1 and cdc20-1 mutants. Immunofluorescence studies of Far10?TM(HA)2 revealed that this mutant protein was indeed mislocalized. These results provide evidence that the ability of Far10 to induce lethality depends on its correct localization to the nuclear membrane [Murray, 2001]. An investigation into the synthetic interactions of FAR10 with cdc20-1 mutant revealed that cdc20-1 far10? double mutants displayed a synthetic growth defect at 25°C. On the other hand far10? cdc23-1 double mutants showed no obvious growth effects when compared to cdc23-1 single mutants. The data imply that APC is fully active at 25°C in far10? cdc23-1 mutants. On the contrary cdc20-1 far10? double mutants at the same temperature may show a defective APC activity. These results propose that when APC-Cdc20 activity is disturbed, presence of Far10 is required. The mitotic exit network [MEN] in budding yeast is a complex signaling cascade consisting of Tem1 (a GTPase); Cdc15, Dbf2 and Cdc5 (protein kinases); Cdc14 (a protein phosphatase); Mob1 (a Dbf2 associated factor); Bub2-Bfa1/Byr4 (a two component GTPase-activating Protein; GAP); Lte1 (a guanine nucleotide exchange factor; GEF) and a scaffold protein, Nud1 [Amon, 2001]. Tem1 is a positive regulator of MEN. The ultimate effector of MEN is Cdc14 and it is held inactive in the nucleolus by its inhibitor Cfi1/Net1 during G1, S, G2 and early M phase. MEN is activated when the spindle pole body reaches daughter cell where Lte1 (GEF) exchanges a GDP for GTP on Tem1. Thus activated, Tem1-GTP binds to and activates Cdc15, which in turn activates Mob1-Dbf2 complex. Dbf2 facilitates release of Cdc14 from the nucleolus. The freed Cdc14 functions to shut down mitotic Cdk activity by promoting expression of the Cdk inhibitor Sic1 and stimulation of degradation of the essential mitotic cyclins. To outline the relation(s) of FAR10 with regulatory modules of the mitotic exit network a genetic method was executed. For this purpose, effects of FAR10 overexpression and inactivation were studied in MEN mutants. Overexpression of FAR10 in a string of MEN mutants was found to cause toxicity in cdc14-3, dbf2-2, and tem1-3 mutants, with cdc15-2 and cdc5-1 mutants displaying a mild effect and lte1? mutant showing no effect at all. These results prove that when MEN activation is defective cells become sensitive to Far10 overexpression. In contrast when MEN is hyperactive as in the case of bub2? mutants, the effect of overexpression of FAR10 is suppressed. FAR10 is not an essential gene and its deletion causes no obvious growth defects when compared to wild type (W303) strain. Though far10? cdc14-3 double mutants showed no detectable growth effects at either 25°C or 30°C when compared to cdc14-3 single mutants, deletion of FAR10 in dbf2-2 mutants had a moderate suppression effect at 25°C. In the case of far10? tem1-3 double mutants this suppression effect was enhanced at 32°C revealing that FAR10 may be an inhibitor of mitotic exit. Overexpression of FAR10 causes synthetic dosage effects in mutants that are defective in Clb-CDK inactivation such as hct1-?1 and sic1-?1. These results suggest that a defective Clb-CDK inactivation either to due impaired degradation or absence of inhibition by Sic1 makes cells susceptible to Far10 overexpression. In addition, hct1-?1 far10? and sic1-?1 far10? double mutants showed synthetic growth defect at 30°C, which was markedly enhanced at 37°C. The data prove that presence of Far10 is required under these conditions. The ultimate function of the mitotic exit network in budding yeast is inactivation of the mitotic Clb2-CDK activity, which is followed by cytokinesis resulting in the formation of two daughter cells [Visintin et al., 1998]. In relevance of these findings it was rationalized that an enhancement in Clb-CDK inactivation through ectopic overexpression of Sic1 might alleviate the toxic effects associated with FAR10 overexpression. Henceforth, SIC1(HA)1X was co-overexpressed with FAR10 in cdc23-1, cdc14-3, dbf2-2 and tem1-3 mutants. Results in this case show that co-overexpression of SIC1(HA)1X along with FAR10 did not restore wild type growth rates. An analogous result was obtained when Sic1 was overexpressed in MEN mutants that harbored a deletion of FAR10. The data here propose an ill-defined role for Far10 as an inhibitor of mitotic exit. Additionally, these results also provide evidence that FAR10 may act in parallel to MEN and/or co-operate in triggering exit from mitosis.
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    In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Bedeutung des intestinalen Arzneimittelmetabolismus und -transportes beim Menschen
    (2003) Gläser, Hartmut; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
    Mit dem Nachweis von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (AME) und Arzneimitteltransportern im Dünndarm des Menschen wurde die Bedeutung des intestinalen Metabolismus für die Bioverfügbarkeit oral applizierter Arzneimittel zunehmend erkannt. Die mangelnde Verfügbarkeit von humanen Enterozyten stellt bei Untersuchungen zum intestinalen Arzneimittelmetabolismus und -transport ein wesentliches Problem dar. Zur Expression und ex vivo Funktion von Cytochrom P450 Enzyme sowie deren Modifikation durch Rifampicin in humanen Enterozyten existieren keine systematischen Daten. Auch sind die Kenntnisse über die Expression und in vivo Funktion von intestinalen Arzneimitteltransportern und deren Beeinflussung durch Rifampicin sehr gering. Mit einem multiluminalen Perfusionskatheter (MLPC) zur Gewinnung von humanen Enterozyten und einer Gewebesammlung von Dünndarm- und Leberproben von jeweils demselben Patienten wurde versucht, die o.g. Probleme zu bearbeiten. Die Charakterisierung der mit dem MLPC gewonnenen Zellen zeigte, dass vitale, abgeschilferte Enterozyten gewonnen, und sowohl zur Untersuchung der Expression von AMEs und Transporter als auch zur ex vivo Analyse des intestinalen Metabolismus verwendet werden können. Unter Einsatz des MLPCs wurde in einer Studie die Induktion von CYP2C8, 2C9 und 3A4 durch Rifampicin in den Enterozyten nachgewiesen. Mit Hilfe des MLPCs konnte auch die Funktion und Expression des Arzneimitteltransporters P-Glykoprotein (Pgp) untersucht werden. Für die funktionelle in vivo Analyse wurde Chinidin bei gleichzeitiger i.v. Gabe des Pgp-Substrates Digoxin luminal über den MLPC verabreicht. Damit konnte die Bedeutung des intestinal exprimierten Pgp sowohl für die systemische Elimination von Digoxin als auch für die Resorption von Chinidin nachgewiesen werden. Zudem konnte die Zunahme der Elimination von Digoxin bzw. Abnahme der Chinidinresorption nach Gabe von Rifampicin gezeigt werden. Die Expressionsanalyse von MRP2 in Dünndarm und Leber zeigte keinen Unterschied im Ausmaß der Expression in den beiden Geweben. Die Tatsache, dass im Dünndarm - nicht aber in der Leber - eine Korrelation zwischen MRP2 mRNA und Protein nachgewiesen wurde, gibt einen Hinweis auf unterschiedliche Regulationsmechanismen von MRP2 in den beiden Geweben.
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    Unterschiedliche Funktionen der Ionenpumpe Pmr1
    (2003) Zappe, Andrea; Rudolph, Hans (PD Dr.)
    Freies cytosolisches Ca2+ erfüllt in Eukaryonten für viele zelluläre Prozesse die Funktion eines "second messengers" und unterliegt daher einer exakten Kontrolle, um die normale Physiologie der Zelle aufrecht zu erhalten. Auf einen raschen Anstieg der cytosolischen Ca2+- Konzentration erfolgt ein aktives Entfernen des Ca2+ aus dem Cytosol. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae geschieht dies durch die Ca2+- ATPasen Pmc1 und Pmr1, sowie durch den Ca2+/H+ Antiporter Vcx1. Der Weg auf dem überschüssiges Ca2+ wieder aus der Zelle ausgeschieden werden kann, ist bisher unbekannt. Eine Plasmamembran Ca2+- ATPase, wie von Säugerzellen bekannt, scheint in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nicht zu existieren. Da Ca2+ in allen Subkompartimenten des Sekretionswegs eine wichtige Rolle spielt und zu dem dort im Vergleich zum Cytosol in wesentlich erhöhten Konzentrationen nachgewiesen wurde, liegt es nahe zu vermuten, dass Ca2+- verpackt in sekretorische Vesikel - die Zelle durch Exocytose verlassen könnte. Diese Hypothese wurde an Hand von Ca2+- Ausstrommessungen an verschiedenen Hefestämmen untersucht. Anhand von Stämmen, die aufgrund einer sec- Mutation ein temperatursensitives Sekretionsverhalten aufweisen, konnte gezeigt werden, dass Ca2+ , verpackt in sekretorische Vesikel, entlang des Sekretionswegs zur Plasmamembran transportiert und bei der Fusion der post- Golgi Vesikel mit der Plasmamembran aus der Hefezelle freigesetzt wird. Der Ca2+- Ausstrom erfolgt also über Exocytose. In einem weiteren Projekt wurde der Aminosäuretransport durch die Aminosäurepermease Gap1 in delta- pmr1- Zellen untersucht. Kinetische Transportmessungen mit radioaktiv markierten Aminosäuren ergaben, dass die Transportaktivität von Gap1 in delta- pmr1- Zellen drastisch reduziert ist und dass vermutlich eine Form von unkompetitiver Inhibierung von Gap1 in delta- pmr1-Zellen vorliegt. In einem dritten Projekt wurde nach genetischen Interaktionspartnern von Pmr1 gesucht. Dabei wurde festgestellt, dass delta- pmr1 delta- bst1, delta- pmr1 delta- sac2, delta- pmr1 delta- vps24 Doppelmutanten auf YPD- Platten einen starken Wachstumsdefekt aufweisen.
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    Protein degradation from the mammalian endoplasmic reticulum
    (2009) Müller, Britta; Wolf, Dieter (Prof. Dr. rer. nat.)
    In eukaryotes, one third of all proteins enter the secretory pathway. They do so in the endoplasmic reticulum (ER), an organelle that provides an oxidative environment filled with enzymes and chaperones that aid in protein folding. In the ER, secretory and transmembrane proteins undergo a productive folding cycle, acquire N-linked glycans, and assemble into multisubunit complexes prior to their exit to the Golgi. The surveillance mechanism in the ER that monitors the folding status of a protein is called ER quality control. Quality control ensures that only properly folded and assembled proteins can exit the ER. Accumulation of irreversibly misfolded proteins presents a threat to proper ER homeostasis and function and therefore to cell survival. Proteins that fail quality control are considered misfolded and are selectively retrotranslocated or dislocated into the cytosol for degradation by the cytosolic proteasome, in a process also referred to as ER associated degradation. Two type I ER transmembrane proteins, US2 and US11, encoded by human cytomegalovirus (HCMV), co-opt the cellular dislocation pathway by catalyzing the dislocation of class I MHC (major histocompatibility complex) heavy chain (HC) molecules from the ER to avoid detection by the immune system. US2 and US11 both target the same molecules but do so by recruiting different sets of proteins. US2 uses signal peptide peptidase (SPP) to degrade class I MHC, whereas US11 seems to engage a more conserved pathway superficially similar to that used by yeast: The polytopic transmembrane protein Derlin-1, the homolog of yeast Der1p, is required for dislocation of HCs in US11, but not in US2 expressing cells. Derlin-1 can oligomerize with another member of the Derlin family, Derlin-2. Derlin-2 forms a complex with p97 and with orthologs of the Hrd1p/Hrd3p ligase complex. In this thesis I investigated the contribution of the human ortholog of Hrd3p, SEL1L, to heavy chain dislocation as catalyzed by US11. SEL1L is a type I transmembrane protein with a large globular domain containing multiple repeated regions of the tetratricopeptide repeat (TPR) family, suggesting that it might be involved in substrate recognition. Here I provide evidence that SEL1L is essential for HC dislocation in US11, but not in US2 cells. Furthermore I was able to show that SEL1L is required not only for the degradation of a truncated thereby misfolded version of ribophorin (RI332), but also binds only to misfolded RI332, and not to properly folded ribophorin. To further investigate SEL1L's role in dislocation, I performed a biochemical search for SEL1L-interacting proteins. I identified OS9, AUP1, and UBXD8 as part of the dislocation machinery. Furthermore, I identified an ER membrane bound ubiquitin conjugating E2 enzyme, UBC6e, as required for HC dislocation in US11 cells. We designed dominant negative versions of UBXD8 and AUP1 by constructing C-terminal fusions with GFP. Expression of these constructs leads to inhibition of HC dislocation in US11 cells. OS9, the ortholog of yeast Yos9p, a protein involved in dislocation of glycosylated proteins, does not appear to be involved in HC dislocation. Overexpression of OS9 mutants in which the putative lectin binding domain of OS9 was disrupted, as well as overexpression of wild-type OS9 frustrate dislocation of RI332, but have only a very mild effect on HC dislocation. This result suggests that US11 assumes the role of OS9 in substrate recognition and selection. Further analysis of UBC6e led to an intriguing connection between proteins involved in ER dislocation and immune function, possibly cross-presentation. UBC6e is highly expressed in dendritic cells and can be phosphorylated upon ER stress. I found that UBC6e can be quantitatively phosphorylated upon stimulation with various Toll-like receptor (TLR) ligands, and that this phosphorylation is dependent on an intact toll-like receptor signaling pathway. Dendritic cells from mice with compromised TLR signaling do not show phosphorylation of UBC6e. The observed cross-talk between chemicals that induce ER stress and between agonists of TLR signaling uncovers new aspects of TLR biology.
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    Protein quality control and degradation of the Endoplasmic Reticulum : elucidation of components and mechanisms of the retrotranslocation system
    (2006) Xiao, Li; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr. )
    The endoplasmic reticulum (ER) is an intracellular membranous system of all eukaryotic cells where most of the secretory proteins acquire their native tertiary structure. The ER contains a highly active quality control system. Malfolded proteins are selectively recognized in the ER and transported back to the cytoplasm, where they are finally degraded by the 26S proteasome in an ubiquitin dependent manner. The latter process is known as ER associated degradation (ERAD). Failure of this process leads to formation of protein aggregates and results in impaired cell function. To understand how ERAD related components cooperatively participate in ER degradation and to get a better insight if Sec61p is really the pore-forming unit of the protein retrotranslocon, Blue Native Electrophoresis (BN) and co-immunoprecipitation techniques were applied in this study. To determine the composition of the retrotranslocon and to obtain new information on the entire process involved in ERAD, a series of CPY* fusion protein substrates with special structural characteristics were constructed and investigated. Using Blue Native electrophoresis, a stable Der3-Hrd3p complex was detected. The finding of the Der3-Hrd3p complex together with soluble malfolded substrates as CPY* or CPY*GFP and membrane substrates as CT* or CTG*, indicated that Der3-Hrd3p complex acts as a part of a retrotranslocation machinery. The AAA ATPase Cdc48p was also found in this Der3-Hrd3p complex when using Blue Native electrophoresis, indicating the existence of a Cdc48-Der3-Hrd3p complex. The finding of the interaction between Cdc48 and the Der3-Hrd3p complex by co-immunoprecipitation experiments confirmed this complex composition. Blue Native electrophoresis showed two stable Sec61-Sec62-Sec63p complexes (430kDa and 480kDa), the composition of which did not undergo changes in any of the ERAD mutants, indicating that these might constitute the protein import complex. Further insights into the retrotranslocation process was intended to reach with the help of new ERAD substrate CPY*GAr215, a CPY* derivative containing a long Glycine-Alanine repeat sequence. Previous work by Thomas Bohnacker (Diplomarbeit, Universität Stuttgart, 2004) has indicated that full length CPY*GAr215-HA3 is only "processed". A partial degradation product appeared, displaying a loss of the C-terminal part of the protein. Full length and the intermediates of CPY*GAr215-HA3 were shown here to be glycosylated and located in ER vesicles. It was observed here that there is a slight growth reduction in temperature sensitive Sec61-2 cells overexpressing CPY*GAr215 at 35°C. Sec61p was found to interact with Cdc48p and both, full length and intermediates of CPY*GAr215 by co-immunoprecipitation experiments. Remarkably, Blue Native electrophoresis also indicated the existence of a Sec61-Cdc48-CPY*GAr215 complex in wild type cells. All together, this work suggests the existence of a Sec61-Cdc48-Der3/Hrd3-CPY*GAr215 complex which might form a dynamic retrotranslocon in ER degradation. With the help of biochemical methods, the results in this study show the existence and dynamic changes of Cdc48-Der3-Hrd3-substrate protein complexes. This might constitute at least in part the scaffold of the retrotranslocon. Sec61p, as a pore-forming protein, might be involved in the retrotranslocation process. Cdc48 protein complex might act as a linker between the pore and ubiquitination system, and the proteasome, handing over the ubiquitinated substrates from cytosolic face of the ER to 26S proteasome for final degradation.