03 Fakultät Chemie
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Molecular modeling of hydrophobic effects in complex biomolecular systems : from simple mixtures to protein-interface aggregation(2014) Benson, Sven P.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Hydrophobicity is a term commonly used to discuss the formation of molecular structures in aqueous solution, and since water is ubiquitous in cellular systems, it may be applied in virtually every biomolecular context. Hydrophobicity is not a first-principle parameter but an abstract concept to describe the “behavior” of molecules in aqueous environments. The terminology of hydrophobicity is misleading, because it implies repulsion or a lack of attraction between nonpolar groups and water, when in fact attractive interactions persist due to atom dipoles. Although it has long been recognized that the driving force of structure formation in aqueous environments is founded in water’s “narcissism”, i.e., water self-preference, rather than in a general “fear of water”, the term hydrophobicity has established itself ever since Kautzmann related protein stability to hydrophobic interactions. Due to its false implications, hydrophobicity can be a cause of confusion and the culprit of misleading deductions. Presented in this dissertation is the author’s work on the structural and dynamical characterization of hydrophobic effects in biomolecular systems in the broadest sense, whereby molecular systems on three different size scales are covered: binary mixtures of methanol and water, aggregation of triglyceride droplets in aqueous solution and enzymes that interact with triglyceride-water interfaces of large-scale triglyceride aggregates.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen(2009) Steudle, Alexander Patrick; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie. Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte. Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt. Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden. MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.Item Open Access Zur Anwendbarkeit von Squalen-Hopen-Zyklasen als chirale Brønsted-Säuren in der asymmetrischen Katalyse(2014) Hammer, Stephan C.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Anwendung von Enzymen und Mikroorganismen als Katalysatoren in der organischen Synthese hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als eine ernsthafte Ergänzung zur rein chemischen Katalyse etabliert. Jedoch ist die Bandbreite an biokatalytisch durchführbaren Reaktionen sehr gering. Für eine Vielzahl an synthetisch wertvollen Reaktionen wurden entsprechende Enzyme von der Natur nicht evolviert oder bisher nicht entdeckt. Die Entwicklung solcher Enzyme für die Katalyse nicht-physiologischer chemischer Transformationen ist ein zum größten Teil unerforschtes Arbeitsgebiet. Ein Ansatzpunkt ist die Nutzbarmachung bereits vorhandener enzymatischer Katalysezentren. Dies ist auch von besonders großer Bedeutung, da viele der in der organischen Chemie divers eingesetzten Aktivierungsmodi Bestandteil des enzymatischen Repertoires sind. Jedoch werden diese hoch-entwickelten enzymatischen Katalysezentren von der Natur häufig nur sehr spezialisiert eingesetzt und im Labor nur selten gezielt für nicht-natürliche Reaktionen entwickelt. In diesem Grenzgebiet, zwischen der organischen Synthesechemie und dem Enzymdesign, befindet sich der Fokus der hier vorliegenden Arbeit. Ziel war die Entwicklung einer Plattform für die enzymatische Brønsted-Säure-Katalyse. Dies ermöglicht einen potentiellen biokatalytischen Zugang zu einer Vielzahl an nicht-physiologischen, jedoch synthetisch wertvollen chemischen Transformationen, da die chirale Brønsted-Säure-Katalyse in der organischen Chemie zur Durchführung einer Vielzahl an wichtigen C-C-bindungsknüpfenden Reaktionen verwendet wird. Dieser Ansatz verbindet die leistungsstarke Brønsted-Säure-Katalyse mit den Vorteilen der Biokatalyse, namentlich den oft exzellenten Selektivitäten zusammen mit hohen Aktivitäten basierend auf einer Synthese in Wasser als „grüneres“ Lösungsmittel. Biokatalysatoren sind genetisch kodiert und lassen sich somit mikrobiell synthetisieren und einfach durch genetische Manipulation optimieren. Während die allgemeine Brønsted-Säure-Katalyse bei Enzymen eine wichtige Rolle spielt (z. B. bei der Stabilisierung von Übergangszuständen durch Bildung von Wasserstoffbrücken-bindungen) ist die enzymatische, spezifische Brønsted-Säure-Katalyse nicht beschrieben. Eine Ausnahme bilden hier die Squalen-Hopen-Zyklasen (SHCs), welche die kationische Polyzyklisierung von Squalen zu den pentazyklischen Produkten Hopen und Hopanol katalysieren. Zur Protonierung der terminalen C=C-Bindung des Substrates nutzen SHCs eine Asparaginsäure mit biologisch ungewöhnlich hoher Acidität. Während dieser Doktorarbeit wurde das katalytische Potential dieser einzigartigen Protonierungsmaschinerie studiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das natürliche Reaktionsspektrum dieses katalytischen Zentrums (ausgestattet mit der hoch-aciden Asparaginsäure) untersucht. Durch die Verwendung verschiedener bioinformatischer Methoden wurden Proteinsequenzen evolutionär verwandter Enzyme ermittelt. Somit wurde eine Superfamilie an protonierenden Enzymen (Protonasen) identifiziert und bezüglich deren beschriebener Funktionen analysiert. Diese Studien zeigen, dass sich das Reaktionsspektrum dieser Protonase-Superfamilie in der Natur auf die Polyzyklisierung einiger weniger linearer Terpene beschränkt, ganz im Gegensatz zu der enormen Diversität Brønsted-Säure-katalysierter Reaktionen in der organischen Chemie. Das Substratspektrum der SHCs und dabei besonders des Enzymes aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurde in der Vergangenheit mehrfach adressiert, wobei sich die Studien auf Polyzyklisierungen Squalen-artiger Substratanaloga beschränkten. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Substratspektrum für Polyzyklisierungsreaktionen auf funktionalisierte Polyprenoide erweitert. Insbesondere wurde gezeigt, dass Aromaten und Amide als Nukleophile in der kationischen Polyzyklisierung verwendet werden können, um die Reaktionen zu terminieren. Somit sind formal die stereoselektive Friedel-Crafts-Alkylierung sowie die Hydroamidierung Bestandteil des Reaktionsportfolios der SHCs. Neben der AacSHC wurde in diesem Teil der Arbeit auch eine weitere SHC aus Zymomonas mobilis (ZmoSHC1) verwendet, wobei sich beide Enzyme nur minimal in ihren Funktionen unterschieden. Das Substratspektrum der SHCs ist bezüglich der Substratgröße beschränkt. Während sich mittelgroße Sesqui- und Diterpen-Derivate selektiv und mit guter Aktivität zu bi- und trizyklischen Verbindungen umsetzen lassen, werden Monoterpen-Derivate von den Wildtyp-Enzymen nicht zu den entsprechenden chiralen Cyclohexanoiden zyklisiert. Synthetisierte Modellsubstrate wurden in einem dritten Teil dieser Arbeit verwendet, um diese Limitierung zu untersuchen. Hierzu wurden die Aktivitäten bei enzymatischen Umsetzungen mit molekulardynamischen Simulationen verglichen. Somit wurde ein Zusammenhang zwischen der Substratbindung in einer reaktiven Konformation und der jeweiligen Aktivität aufgezeigt. Daraus lässt sich ableiten, dass vermutlich nicht die katalytische Maschinerie die SHCs auf die Polyzyklisierungschemie beschränkt, sondern die Struktur des hochselektiven aktiven Zentrums. Dieses aktive Zentrum diskriminiert nicht-natürliche Substrate durch die limitierte Fähigkeit diese in einer reaktiven Konformation zu binden. Um SHCs zu „Protonasen“ für unterschiedliche nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln, ist deshalb ein breites Set an unterschiedlichen Geometrien des aktiven Zentrums nötig. Dementsprechend lassen sich potentielle Substrate für unterschiedliche Reaktionstypen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit in einer reaktiven Konformation binden. Jedoch sind die aktiven Zentren der SHCs und auch verwandter Triterpen-Zyklasen hochkonserviert. Die nötige Diversität an Enzymen lässt sich somit nicht aus dem natürlichen Pool an Katalysatoren rekrutieren. Aus diesem Grund wurde in einem vierten Teil der Arbeit eine Mutantenbibliothek der AacSHC erstellt. Mit einer rationalen Mutationsstrategie (hydrophobe Substitution) wurde die AacSHC zu einem Set an hochselektiven „Protonasen“ entwickelt und damit die Anwendbarkeit als chirale Brønsted-Säure in der asymmetrischen Katalyse untersucht. Die erzeugten Varianten zeigten Aktivitäten für unterschiedliche chemische Transformationen bei gleichzeitiger Protonierung verschiedener funktioneller Gruppen (Alken, Epoxid und Carbonyl). Dies ermöglichte die Darstellung interessanter Cyclohexanoide mit guten Aktivitäten und exzellenten Stereoselektivitäten (>99 % ee/de). Die praktische Anwendbarkeit wurde in semi-präparativen Umsetzungen aufgezeigt. So wurde zum Beispiel 512 mg Geraniol mit der Variante AacSHC G600F zu einem Cyclohexanoid umgesetzt (32 % isolierte Ausbeute). Demzufolge wurde durch die Einführung einer Punktmutation ein beinahe inaktives Wildtyp-Enzym zu einem praktisch anwendbaren Katalysator evolviert. Verdeutlicht werden die exzellenten Selektivitäten (Regio-, Stereo- und Produktselektivitäten) durch die exklusive Umsetzung von (S)-6,7-Epoxygeraniol aus dem entsprechenden Racemat (inklusive der regioselektiven Deprotonierung des Carbokation-Intermediates), die hochstereoselektive Synthese (>99 % de) von (-)-iso-Isopulegol aus (S)-Citronellal oder durch die stereoselektive Wasseraddition an das Carbokation-Intermediat der Zyklisierung von Geraniol. Der Ursprung der hohen Selektivitäten liegt in der Geometrie des aktiven Zentrums. Ausgehend von unterschiedlichen reaktiven Konformationen (welche zu unterschiedlichen Produkten führen können), werden die Substrate von den „Protonasen“ selektiv in einer bestimmten reaktiven Konformation gebunden und dadurch selektiv aktiviert. Zusammenfassend wurde die einzigartige Protonierungsmaschinerie der SHCs von der Polyzyklisierungschemie befreit und für nicht-natürliche Reaktionen in die asymmetrische Katalyse eingeführt. Darüber hinaus leistet diese Arbeit einen methodischen Beitrag in der Entwicklung neuer Biokatalysatoren, da sie aufzeigt, dass Enzyme und deren Katalysezentren systematisch für nicht-physiologische Reaktionen entwickelt werden können. Dies ist interessant für die Etablierung neuer Biosynthesewege sowie für die Erweiterung der Reaktionsportfolios in der organischen Synthese (Stichwort: chirale Brønsted-Säure-Katalyse in Wasser).Item Open Access Studie zur Entwicklung eines neuen Biokatalysators zur Darstellung von vicinalen Aminoalkoholen(2015) Stahmer, Juliane; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Das Ziel der Biokatalyse ist der Einsatz von Enzymen in der chemischen Industrie, um großtechnische Verfahren nachhaltiger und umweltfreundlicher zu gestalten. Oft werden zur Herstellung von Bausteinen für Pharmazeutika oder Kosmetika metallabhängige oder Organokatalysatoren eingesetzt, die in ihrer Herstellung meist teuer und toxisch sind. Obwohl es bereits einige Enzyme gibt, die Anwendung finden, gibt es noch sehr viele Reaktionen, für die es noch kein enzymkatalysiertes Pendant gibt. Die Aufgabe der modernen Biokatalyse besteht also darin, Enzyme für neue nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher die Entwicklung eines neuen Biokatalysators für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen untersucht und studiert. Die dabei resultierenden vicinalen Aminoalkohole sind wichtige Zwischenprodukte für verschiedene Anwendungsgebiete der chemischen Industrie. Ihre chemische Herstellung basiert auf der Verwendung von teuren und toxischen Katalysatoren oder sie laufen nicht genügend selektiv ab. Eine Möglichkeit der Entwicklung neuer Enzyme für nicht-natürliche Reaktionen stellt die Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren dar. Dies ist eine gute Option, da viele in der organischen Synthese verwendeten Aktivierungstriebkräfte, wie zum Beispiel Säurekatalyse, auch in Enzymen auffindbar sind. Die organische Chemie und das Enzymdesign finden so einen Kontaktpunkt, der im Zuge dieser Arbeit ausgenutzt werden soll. So wurden drei Ansätze entwickelt, von denen zwei auf der Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren beruhen und die dritte auf dem computerbasierten de novo Enzymdesign. Es wurden zwei Enzyme ausgewählt, die bereits ein aktives katalytisches Zentrum zur Epoxidringöffnung mit Nukleophilen, wie Wasser oder Halogeniden, besitzen. Zum einen wurde die Halohydrindehalogenase aus Agrobacterium radiobacter AD1 ausgewählt, um das vorhandene Nukleophilspektrum um NH-Nukleophile, wie Amide, Amidine oder Harnstoff zu erweitern. Zum Anderen sollte das Nukleophilspektrum der Limonen-1,2-epoxidhydrolase aus Rhodococcus erythropolis DCL14 um primäre und sekundäre Amine erweitert werden. Die bestehende Konkurrenz eines neuen nicht-natürlichen Nukleophils zum Wassernukleophil sollte durch gezieltes Ändern der aktiven Taschen mittels site-directed mutagenesis und durch Immobilisationstechniken abgeschwächt oder unterdrückt werden. Allerdings führten die Reaktionen der Varianten der genannten Enzyme mit verschiedenen Epoxiden und den genannten NH-Nukleophilen nicht zum gewünschten Erfolg. Als dritter Ansatz diente die Verwendung der Rosetta Methode, die in Zusammenarbeit mit Dr. Sinisa Bjelic (University of Washington, Seattle, USA) benutzt wurde, um Enyzmmodelle in silico zu erstellen, welche gewünschte Eigenschaften für die bimolekulare Epoxidringöffnungsreaktion enthielten. Die gewählten Substrate 3-Nitrostyroloxid und 3,4-Chloromethoxyanilin zeigten bereits eine geringe unselektive Hintergrundreaktion, deren Aktivität und Selektivität durch die Verwendung von de novo Enzymen gesteigert werden sollte. Sechs der 13 synthetischen de novo Gene konnten exprimiert und aufgereinigt werden. Gegenüber der Wunschreaktion zeigten sie allerdings keine Aktivität. Mittels STD-NMR konnte gezeigt werden, dass die gewählten Substrate an eines der Enzyme binden, allerdings konnte keine Aussage darüber getroffen werden, ob sie in der aktiven Tasche binden. Eine anschließende Untersuchung der verwendeten Übergangszustände gab Aufschluss über die nicht vorhandene Aktivität. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit die auftretenden Schwierigkeiten des Enzymdesigns für neue nicht-physiologische Reaktionen gezeigt werden. Es konnte zwar kein neuer Biokatalysator für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen entwickelt werden, jedoch zeigten die Untersuchungen die Schwachstellen auf, die nun in zukünftigen Arbeiten in diesem Gebiet umgangen werden können.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.