03 Fakultät Chemie
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Impact of remote mutations on metallo-beta-lactamase substrate specificity : implications for the evolution of antibiotic resistance(2005) Ölschläger, Peter; Mayo, Stephen L.; Pleiss, JürgenMetallo-beta-lactamases have raised concerns due to their ability to hydrolyze a broad spectrum of beta-lactam antibiotics. The G262S point mutation distinguishing the metallo-beta-lactamase IMP 1 from IMP 6 has no effect on the hydrolysis of the drugs cephalothin and cefotaxime, but significantly improves catalytic efficiency toward cephaloridine, ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem. This change in specificity occurs even though residue 262 is remote from the active site. We investigated the substrate specificities of five other point mutants resulting from single nucleotide substitutions at positions near residue 262: G262A, G262V, S121G, F218Y and F218I. The results suggest two types of substrates: type I (nitrocefin, cephalothin and cefotaxime), which are converted equally well by IMP-6, IMP-1, and G262A, but even more efficiently by the other mutants, and type II (ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem), which are hydrolyzed much less efficiently by all the mutants, with IMP-1 being the most active. G262V, S121G, F218Y, and F218I improve conversion of type I substrates, whereas G262A and IMP-1 improve conversion of type II substrates, indicating two distinct evolutionary adaptations from IMP-6. Substrate structure may explain the catalytic efficiencies observed. Type I substrates have R2 electron donors, which may stabilize the substrate intermediate in the binding pocket and lead to enhanced activity. In contrast, the absence of these stabilizing interactions with type II substrates may result in poor conversion and increased sensitivity to mutations. This observation may assist future drug design. As the G262A and F218Y mutants confer effective resistance to Escherichia coli BL21(DE3) cells (high minimal inhibitory concentrations), they are likely to evolve naturally.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen(2009) Steudle, Alexander Patrick; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie. Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte. Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt. Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden. MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.Item Open Access A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol(2001) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenTransesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures (1, 10, 50, and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result, E significantly decreased with increasing pressure from E=55 (1 bar) to E=47 (10 bar), E=37 (50 bar), and E=9 (100 bar). In order to rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1, 10, 50, and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase, this cavity is filled with 6 water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure: 6 molecules in the simulation at 1 bar, 10 molecules at 10 bar, 12 molecules at 50 bar, and 13 molecules at 100 bar. Likewise, the volume of the cavity progressively increased from about 1864 ų in the simulation at 1 bar to 2529 ų at 10 bar, 2526 ų at 50 bar, and 2617 ų at 100 bar. At 100 bar, one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (non-preferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate, a factor determining the enantioselectivity of the lipase. While the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations, the geometry of the non-preferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.Item Open Access Rapid detection of neurotoxic insecticides in food using disposable acetylcholinesterase-biosensors and simple solvent extraction(2002) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D.; Bachmann, Till T.The extensive use of pesticides to protect agricultural crops necessitates reliable tools for the detection of residues in food and water, thus ensuring environmental protection and consumer safety. Neuroinhibitors such as organophosphates and carbamates in particular, represent a potential hazard to human health. These compounds are frequently found in food but conventional methods of analysis are limited as they are either time consuming or not sufficiently sensitive. As a result, a rapid and sensitive biosensor test based on AChE-inhibition was developed. The disposable AChE-biosensor was directly applied in solvent extracts of food samples using isooctane as extraction solvent. A complete assay could be performed in less than 2 hours. Recovery rates of 84 % were obtained in tests with spiked orange juice samples. Tests in food samples with a lower water content resulted in reduced recovery rates (44 % for peach pap baby food). Phosphorothionate insecticides could be detected after direct oxidation in food with N-bromosuccinimide and solvent extraction. The assay displayed a detection limit of 2 μg/kg paraoxon which was sufficient for the monitoring of maximum residue limits in food according to EU regulations.