03 Fakultät Chemie
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Item Open Access Regulation of the catalytic activity and specificity of DNA nucleotide methyltransferase 1(2014) Bashtrykov, Pavel; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)DNA nucleotide methyltransferase 1 (Dnmt1) is mainly responsible for the maintenance of DNA methylation in mammals and plays a crucial role in the epigenetic control of gene expression. Dnmt1 recognizes and methylates hemimethylated CpG sites formed during DNA replication. In the present work, the mechanistic details of the substrate recognition by the catalytic domain of Dnmt1, the possible role of the CXXC and RFTS domains of Dnmt1 in the regulation of specificity and activity of Dnmt1, and the influence of the Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing 1 (Uhrf1) protein on the enzymatic properties of Dnmt1 was investigated. Using modified substrates, the functional roles of individual contacts of the Dnmt1 catalytic domain with the CpG site of the DNA substrate were analysed. The data show that the interaction with the 5-methylcytosine:guanine pair is required for the catalytic activity of Dnmt1, whereas the contacts to the non-target strand guanine are not important, since its replacement with adenine increased the activity of Dnmt1. It was proposed that the CXXC domain binding to unmethylated CpG sites increases the specificity of Dnmt1 for hemimethylated DNA. Our data showed that the CXXC domain does not influence the enzyme’s specificity in the full-length Dnmt1. In contrast, mutagenesis in the catalytic domain introducing an M1235S exchange resulted in a significant reduction in specificity. Therefore, the readout for the hemimethylated DNA occurs within its catalytic domain. It was observed in a crystal structure that the RFTS domain of Dnmt1 inhibits the activity of the enzyme by binding to the catalytic domain and blocking the entry of the DNA. By amino acid substitution in the RFTS domain its positioning within the catalytic domain was destabilized and a corresponding increase in the catalytic rate was observed, which supports this concept and suggests a possible mechanism to allosterically regulate the activity of Dnmt1 in cells. Uhrf1 has been shown to target Dnmt1 to replicated DNA, which is essential for DNA methylation. Here it is demonstrated that Uhrf1 as well as its isolated SRA domain increase the activity and specificity of Dnmt1 in an allosteric mechanism. The stimulatory effect was independent of the SRA domain’s ability to bind hemimethylated DNA. The RFTS domain of Dnmt1 is required for the stimulation, since its deletion or blocking of its interaction with the SRA domain, significantly reduced the ability of Uhrf1 to increase the activity and specificity of Dnmt1. Uhrf1, therefore, plays multiple roles that support DNA methylation including targeting of Dnmt1, its stimulation and an increase of its specificity.Item Open Access Strukturelle, elektrochemische und spektroskopische Untersuchungen von bioinspirierten Modellkomplexen mit N,S-Liganden(2010) Schnödt, Johannes; Kaim, Wolfgang (Prof. Dr.)Durch die strukturelle Aufklärung der aktiven Zentren von Proteinen und Enzymen hat sich ein interdisziplinäres Forschungsgebiet entwickelt, das versucht entsprechende Modellsysteme als Katalysatoren zu nutzen. Insbesondere Elektronen übertragende Proteine, wie Plastocyanin sowie oxygenierende Enzyme, wie die Peptidylglycin-a-hydroxylierende Monooxygenase, die einen Redoxprozess und einen Sauerstofftransfer verbinden, sind in den Blickpunkt gerückt. In der vorliegenden Dissertation werden die Synthesen und die strukturellen Aufklärungen von bioinspirierten Modellkomplexen mit stickstoff- und schwefelhaltigen Liganden ausführlich beschrieben. Neben den spektroskopischen Eigenschaften dieser Komplexe liegt der Fokus auf den Untersuchungen der elektrochemischen Eigenschaften dieser Redoxsysteme im besonderen Maße im Hinblick auf die Rolle des Schwefels.Item Open Access Synthese und Charakterisierung von amphipolaren Blockcopolymeren und Untersuchung des Phasenverhaltens in Mischungen mit Polypropylen(2012) Curcic, Tamar; Eisenbach, Claus Dieter (Prof. Dr. )Um Polypropylen (PP) / Polyamid (PA)-Mehrschichtfolien mit verbesserten mechanischen, optischen und permeationstechnischen Eigenschaften ohne Verwendung von speziellen Haftvermittlerschichten herzustellen, wurden Diblockcopolymere eingesetzt. Diese können dem PP und/oder PA in einem Zweischneckenextruder als Additiv zugemisch werden. Bei diesem Konzept wird versucht, die Grenzflächenspannung an der PP/PAGrenzfläche herabzusetzen und dadurch nach der Zusammenführung der einzelnen Schichten eine Verbundhaftung zu erzielen. Da die Blendmorphologie die Eigenschaften der Materialien entscheidend beeinflusst, sollten zuerst das Phasenverhalten der PP / HV Blends sowie die Anreicherung der Blockcopolymere an der PP-Oberfläche untersucht werden. Ziel dieser Arbeit war es, das thermische Verhalten, das Phasenverhalten sowie die Oberflächeneigenschaften von Blends, bestehend aus PP und Blockcopolymeren Poly((ethylen-alt-propylen)-b-oxyethylen) (PEP-PEO), mit unterschiedlichen Blocklängenverhältniss zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden amphiphile Blockcopolymere PEP-PEO als Modelladditive mit definiertem Molekulargewicht und Blocklängenverhältnis des Poly(oxyethylen)- und C2-verzweigten Polyethylenblocks hergestellt und charakterisiert. Die Synthese des Blockcopolymers Poly((ethylen-alt-propylen)-b-oxyethylen) erfolgte durch anionische Polymerisation von Isopren und Ethylenoxid. Die Synthese stellte eine dreistufige Reaktion dar. Im ersten Schritt wurde Isopren polymerisiert. Danach wurde der Isoprenblock hydriert und im letzten Schritt wurde der Ethylenoxidblock aufgebaut. So hat man die Möglichkeit, die sequenzielle Analytik betreiben zu können und dazu noch die Verträglichkeit von PEP-Blöcken unterschiedlichen Molmassen mit Polypropylen zu prüfen. Die Versuche zur Bestimmung der Verträglichkeit von PP und PEP haben gezeigt, dass PEP mit Mn= 5000 nur bedingt in Polypropylen löslich ist. Hingegen zeigt PEP mit Mn=15000 uneingeschränkte Löslichkeit mit Polypropylen. PP/PEP(Mn=5000)-Blends waren ab 8 Gew. % an Blockcopolymerantel brüchig und trüb. Blends bestehend aus PP und PEP(Mn=15000 g/Mol) waren hingegen bis einschliesslich 20 Gew % an BP-Anteil durchsichtig und elastisch. Da Bulk- und Oberflächeneigenschaften im engen Zusammenhang stehen, wurden die PP/BP-Blends hinsichtlich dieser Eigenschaften charakterisiert. Für Bulkeigenschaften wurde das Mischungsverhalten der Blends mittels Wärmeflusskalorimetrie (DSC) untersucht. Für die Charakterisierung der Oberflächeneigenschaften kamen oberflächensensitive Methoden wie IRSpektroskopie mit ATR-Technik und Benetzungsanalyse zum Einsatz. Außerdem wurden wärmeflußkalorimetrische (DSC) und schmelzrheologische Studien für die Bestimmung des Phasenverhaltens der Systeme unter dynamischen Bedingungen eingesetzt. Am Beispiel des Blendsystems PP/PEP-PEO ist die Gültigkeit des Zeit-Temperatur-Superpositionsprinzips exemplarisch für die untersuchten Blends in dieser Arbeit untersucht worden. Die Analyse zeigt, dass das Modellblendsystem PP/BP-2b das Zeit-Temperatur-Superpositionsprinzip mit zunehmendem Diblockcopolymergehalt immer weniger erfüllt. Die Interpretation der Messergebnisse lässt sich auf Grundlage der Perkolationstheorie erklären. Beim Auftragen des Speichermoduls gegenüber dem Gewichtsanteil an Blockcopolymer resultierte eine Kurve, die sich mit Hilfe der error Funktion komplett wiedergeben ließ. Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass bei den untersuchten Polymerblends die beobachtete Änderung des Speichermoduls als Perkolationseffekt zu deuten ist und der Verlauf der Kurve den Perkolationsgesetzmäßigkeiten folgt. Der beobachtete Effekt korreliert sehr gut mit den in Kap. 7 erläuterten Abhängigkeiten des Phasenverhaltens von Blockcopolymergehalt im Blend.Item Open Access Gelled bicontinuous microemulsions : a new type of orthogonal self-assembled systems(2013) Laupheimer, Michaela; Stubenrauch, Cosima (Prof. Dr.)In this work a new type of orthogonal self-assembled systems, namely a gelled bicontinuous microemulsion, was investigated with a set of complementary physico-chemical methods. Orthogonal self-assembly means that different structures self-assemble simultaneously in a system and coexist independently. In the chosen model system H2O – n-decane / 12-hydroxyoctadecanoic acid (12-HOA) – tetraethylene glycol monodecyl ether (C10E4) the organogelator 12-HOA forms a network which is surrounded by bicontinuous microemulsion domains. This was proved by comparing characteristic properties and the microstructure of the gelled bicontinuous microemulsion with those of the two ‘base systems’, i.e. the non-gelled bicontinuous microemulsion H2O – n-decane – C10E4 and the binary gel n-decane / 12-HOA. Firstly, phase studies were carried out which showed that the microemulsion phase boundaries are maintained upon gelation, merely shifted by about 6 K to lower temperatures. Likewise, a sol-gel transition occurs in the gelled microemulsion just as in the binary gel. Differential scanning calorimetry and temperature-dependent oscillating shear rheometry measurements revealed that the sol-gel transition temperature is about 20 K lower when a microemulsion, instead of pure n-decane, surrounds the gelator network. This reflects that part of the surface-active 12-HOA molecules adsorb at the water-oil interface instead of forming gelator fibers when a microemulsion is present. Accordingly, studying the linear viscoelastic range and the frequency-dependence of the storage and the loss modulus it was found that the gelator network is somewhat weaker in the gelled bicontinuous microemulsion than in the binary gel, although both systems are strong gels. In the following the focus turned to the microstructure of the gelled bicontinuous microemulsion. To begin with, the bicontinuity of the microemulsion domains in the middle of the one-phase region was verified determining the relative self-diffusion coefficients of water and n-decane with Fourier transform pulsed-gradient spin-echo 1H-NMR measurements. Subsequently, the coexistence of the bicontinuous microemulsion domains and the gelator network in the gelled bicontinuous microemulsion was evidenced by means of small angle neutron scattering. Finally, a visualization of the coexisting microstructures with freeze-fracture transmission electron microscopy complemented the work.Item Open Access Mechanistische Untersuchung zu intermizellaren Wechselwirkungen in lyotropen Flüssigkristallphasen(2015) Schörg, Florian; Gießelmann, Frank (Prof. Dr.)Intermizellare Wechselwirkungen sind für die Bildung lyotroper Flüssigkristallphasen von grundlegender Bedeutung. In dieser Arbeit wurde die Existenz dynamischer Hydrathüllen in mizellaren Systemen gezeigt, die für die Vermittlung intermizellarer Wechselwirkungen über Lösungsmittelschichten hinweg verantwortlich sein können. Als geeignetes Modellsystem wurden hierfür binäre Mischungen des quartären Ammoniumsalzes Cetylethyldimethylammoniumbromid mit Wasser ausgewählt. Durch Messungen mittels dynamischer Lichtstreuung konnten die mizellaren Dimensionen wässriger CEDAB-Lösungen bestimmt werden. Die Untersuchung dynamischer Hydrathüllen erfolgte mittels Absorptionsmessungen im Ferninfrarot-Bereich nach der ATR-Methode. Dabei zeigte sich, dass die Mizellen das sie umgebende Wasserstoffbrückennetzwerk stark beeinflussen und es tatsächlich zur Ausbildung dynamischer Hydrathüllen kommt. Der Übergang in die nematische Phase findet erst statt, wenn das gesamte Lösungsmittel in dynamischen Hydrathüllen gebunden ist und diese zu überlappen beginnen. Anders als bei den für die Entwicklung des Messverfahrens herangezogenen wässrigen Glucose-Lösungen ist im Falle des CEDAB-Systems der Absorptionskoeffizient des Hydratwassers geringer als jener der freien Wassers. Dies kann als eine Schwächung der Wasserstoffbrückenbindungen in den dynamischen Hydrathüllen verstanden werden, die aus der Molekülstruktur resultiert. Die Reichweite des Solvateinflusses auf das Wasserstoffbrückennetzwerk ist jedoch unabhängig davon, ob dieser in einer Stärkung oder einer Schwächung des Wasserstoffbrückennetzwerks resultiert. Durch die Untersuchung wässriger Lösungen des nichtionischen Zuckertensids C8Gluco konnte gezeigt werden, dass in geeigneten lyotropen Systemen auch eine Stärkung der Wasserstoffbrückenbindungen in den dynamischen Hydrathüllen möglich ist. Diese fiel jedoch nicht so deutlich aus wie im Falle des Glucose-Systems, was wiederum auf die Struktur der Moleküle und die Mizellbildung zurückzuführen ist. So stehen im Falle des C8Gluco-Systems für jedes Solvatmolekül weniger als halb so viele Hydroxygruppen für die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Lösungsmittel zur Verfügung. Eines der eindrucksvollsten Beispiele für die Bedeutung intermizellarer Wechselwirkungen ist die chirale Induktion in lyotropen Flüssigkristallphasen, die üblicherweise durch das Hinzufügen chiraler Moleküle als Dotierstoff hervorgerufen werden kann. In dieser Arbeit wurden erstmals helikale Nanopartikel als Dotierstoffe eingesetzt, die um ein Vielfaches größer waren als die Mizellen der lyotropen Wirtsphase. Die Nano-Helices wurden in lyotrop-nematischen Phasen dispergiert, eine einheitliche Probenorientierung konnte durch das Anlegen eines externen Magnetfelds erreicht werden. Durch polarisationsmikroskopische Untersuchungen konnte in den untersuchten Systemen die Bildung helikaler Überstrukturen gezeigt werden. Deren Ganghöhen liegen im Bereich weniger Millimeter, was unter Berücksichtigung der geringen Nanopartikelkonzentrationen in den Lösungen für ein beeindruckendes chirales Induktionsvermögen spricht. Die etablierten Mechanismen der chiralen Induktion in lyotropen Systemen können aufgrund der Größenverhältnisse zwischen den Nanopartikeln und den um zwei bis drei Größenordnungen kleineren Mizellen nicht zur Anwendung gebracht werden. Um die beobachteten Chiralitätseffekte zu erklären wurde deshalb auf ein von Ferrarini und Nordio entwickeltes Modell für die chirale Induktion in thermotropen Flüssigkristallen zurückgegriffen. Dieses beruht auf einem von der chiral verzerrten Oberfläche des Dotierstoffs auf den lokalen Direktor ausgeübten Drehmoment, das innerhalb der Wirtsphase aufgrund von deren Elastizität weitergegeben werden kann. Insgesamt liefert die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse für das Verständnis intermizellarer Wechselwirkungen in lyotropen Systemen. Mit der ATR-Ferninfrarot-Spektroskopie wird erstmals eine neue Methode für die Untersuchung der Hydratation von Mizellen präsentiert, die bei der weiteren mechanistischen Aufklärung des intermizellaren Informationstransports eine wichtige Rolle spielen könnte. Die verwendeten TiO2-Nano-Helices zeigen hingegen ein bemerkenswertes chirales Induktionsvermögen bei der Verwendung als Dotierstoffe in lyotropen Flüssigkristallphasen und erzeugen in orientierten Proben helikale Überstrukturen mit sehr großen Ganghöhen. Somit liefert diese Arbeit wichtige Grundlagen für weitere Untersuchungen, die dabei helfen können, die Mechanismen der Bildung lyotroper Flüssigkristallphasen und der chiralen Induktion in diesen besser zu verstehen.Item Open Access Molecular modeling of hydrophobic effects in complex biomolecular systems : from simple mixtures to protein-interface aggregation(2014) Benson, Sven P.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Hydrophobicity is a term commonly used to discuss the formation of molecular structures in aqueous solution, and since water is ubiquitous in cellular systems, it may be applied in virtually every biomolecular context. Hydrophobicity is not a first-principle parameter but an abstract concept to describe the “behavior” of molecules in aqueous environments. The terminology of hydrophobicity is misleading, because it implies repulsion or a lack of attraction between nonpolar groups and water, when in fact attractive interactions persist due to atom dipoles. Although it has long been recognized that the driving force of structure formation in aqueous environments is founded in water’s “narcissism”, i.e., water self-preference, rather than in a general “fear of water”, the term hydrophobicity has established itself ever since Kautzmann related protein stability to hydrophobic interactions. Due to its false implications, hydrophobicity can be a cause of confusion and the culprit of misleading deductions. Presented in this dissertation is the author’s work on the structural and dynamical characterization of hydrophobic effects in biomolecular systems in the broadest sense, whereby molecular systems on three different size scales are covered: binary mixtures of methanol and water, aggregation of triglyceride droplets in aqueous solution and enzymes that interact with triglyceride-water interfaces of large-scale triglyceride aggregates.Item Open Access Biochemical characterisation of tRNA-Asp methyltransferase Dnmt2 and its physiological significance(2014) Shanmugam, Raghuvaran; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)Methylation of tRNA plays important roles in the stabilisation of tRNAs and accurate protein synthesis in cells. In eukaryotes various tRNA methyltransferases exist, among them DNMT2 which methylates tRNAAsp at position C38 in the anticodon loop. It is also called tRNA-aspartate methyltransferase 1 (Trdmt1) and the enzyme is highly conserved among eukaryotes. In this work, I investigated the mechanism of DNMT2 interaction with tRNAAsp, characterised the function of the only prokaryotic Dnmt2 homolog found in G. sulfurreducens and studied the physiological importance of the C38 methylation of tRNAAsp in mammalian cells. The molecular details of the interaction of DNMT2 and tRNAAsp are unknown due to lack of the co-crystal structure. Here, I characterised the important residues in DNMT2 required for the tRNA binding and catalysis. By site-directed mutagenesis of 20 conserved lysine and arginine residues in DNMT2, I show that 8 of them have a strong effect on the catalytic activity of the enzyme. They map to one side of the enzyme where the catalytic pocket of DNMT2 is located. The binding of most of the mutant enzymes to tRNA was unaffected suggesting a role of these residues in transition state stabilisation. Manual docking of tRNAAsp into the surface cleft decorated by the 8 residues suggested that DNMT2 interacts mainly with the anticodon stem/loop of tRNAAsp. In my second project, I characterised the function of Dnmt2 homolog found in G. sulfurreducens (GsDnmt2). Here, I show that GsDnmt2 methylates tRNAGlu more efficiently than tRNAAsp. I also report the molecular basis for the swapped substrate specificity of GsDnmt2 and show that the variable loops of G.sulfurreducens tRNAAsp and tRNAGlu of eukaryotes contain a -GG- dinucleotide which is not preferred by Dnmt2. Exchange of the variable loop of mouse tRNAAsp to that tRNAGlu led to dramatic decrease in the activity of human DNMT2. This identifies the variable loop of tRNA as a specificity determinant in the recognition by Dnmt2. In my final project, I investigated the physiological importance of the tRNAAsp C38 methylation in aminoacylation and cellular protein synthesis. Here, I report that C38 methylation enhances the rate of aspartylation on tRNAAsp by 4-5 folds. Concomitant with this, a decrease in the charging levels of tRNAAsp was observed in Dnmt2 knockout MEF cells, which also showed a reduced efficiency in the synthesis of proteins containing poly-Asp sequences. A gene ontology searches for proteins with poly-Asp sequences showed that a significant number of these proteins are associated with transcriptional regulation and gene expression functions. With this I propose that the mild phenotype observed with the Dnmt2 KO cells under stress condition could be correlated to a disregulation of protein synthesis.Item Open Access Untersuchungen der spektroskopischen, elektrochemischen und strukturellen Eigenschaften von Übergangsmetallkomplexen mit stickstoffreichen Liganden(2015) Löw, Isabell; Kaim, Wolfgang (Prof. Dr.)Das Interesse an 3,6-disubstitutiierten Derivaten von 1,2,4,5-Tetrazinliganden in der Koordinationschemie beruht auf strukturellen und elektronischen Besonderheiten. Durch die Verwendung dieser stickstoffreichen Liganden wird eine große Vielfalt in der Synthese von stabilen Chelatkomplexen als Einkern und Zweikernkomplexen mit Übergangsmetallen ermöglicht. Tetrazinliganden stellen das elektronenärmste aromatische System in der klassischen H, C, N, O, S-Chemie dar. Dies führt zu einem ausgeprägten π-Akzeptor Verhalten mit der Ausbildung eines energetisch sehr tiefliegenden π* Molekülorbitals, was die Koordination an Übergangsmetalle elektrochemisch wie auch spektroskopisch sehr interessant macht. Die geringe Basizität des Tetrazinings kann mit Hilfe der 3,6-Derivatisierung abgefangen werden. Die leichte Reduzierbarkeit (E > 1.3 V vs. Fc/Fc+) und die Lokalisation des resultierenden Spins auf den vier Tetrazinstickstoffatomen, die durch eine Knotenebene in der 3,6-Position ermöglicht wird, machen diese Liganden zusätzlich interessant. In der vorzulegenden Arbeit werden sowohl symmetrisch als auch asymmetrisch substituierte Liganden mit einer Reihe von Übergangsmetallen zu Einkern bzw. Zweikernkomplexen koordiniert und jeweils untereinander so wie auch mit ähnlichen, bereits literaturbekannten Komplexen verglichen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die [Re(CO)5Cl] Einheit wegen ihrer elektrochemischen und spektroskopischen Eigenschaften, aber auch im Hinblick auf eine mögliche Katalyse der Reduktion von CO2 zu CO verwendet. Weiterhin wurden Rutheniumfragmente mit akzeptierenden Bipyridin Coliganden sowie mit donativen Acetylacetonat Coliganden wegen ihrer hohen Stabilität und der variablen und vielfältigen Redoxchemie verwendet. Auch ein gemischtvalenter Komplex der Form [Ru(acac)2((NMe)2 Tz)(Ru(bpy)2)] konnte synthetisiert und im Hinblick auf sein spezielles Redoxverhalten untersucht werden. Als ein weiterer stickstoffreicher Ligand wurde Bis[N-(2,6-diisopropylphenyl)imino]acenaphten (iPr-BIAN) Ligand in seiner Koordination mit [Cu(PPh3)]+ und den Metallcarbonylfragmenten [Re(CO)3Cl(iPr BIAN)] und [M(CO)3(iPr BIAN)] (M= Mo, W, Cr) synthetisiert und untersucht. Die Verwendung dieses α-Diiminliganden ist im Hinblick auf den Einsatz als Coligand in vielen Bereichen der Katalyse wie zum Beispiel der C C Kreuzkupplung, der homogenen Hydrierung und der Polymerisation von Olefinen interessant. Aus elektronischer Sicht war die postulierte Möglichkeit der Aufnahmefähigkeit von gleich vier Elektronen auch in Komplexen mit Übergangsmetallen zu überprüfen. Der durch die vier Isopropylgruppen verursachte höhere Platzanspruch des Liganden konnte eindrucksvoll an einer auf drei erniedrigten Koordinationszahl in dem Komplex [Cu(PPh3)(iPr BIAN)] demonstriert werden. Alle genannten Komplexe wurden mit Hilfe von 1H NMR, CHN Analyse und Massenspektrometrie charakterisiert und auf Reinheit geprüft, sowie mittels Cyclovoltammetrie und Spektroelektrochemie (UV/Vis/NIR, IR und ESR) hinsichtlich ihres Redoxverhaltens untersucht. Viele Verbindungen konnten kristallographisch charakterisiert werden.Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Cytosolic protein quality control of the orphan protein Fas2, a novel physiological substrate of the E3 ligase Ubr1(2013) Scazzari, Mario; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)Cellular protein quality control (PQC) monitors the proper folding of polypeptides, assembly of protein subunits into protein complexes as well as the delivery of terminally misfolded proteins to degradation. The components of PQC known best at the moment are molecular chaperones and the ubiquitin proteasome system. In contrast to the well-described protein quality control system of the endoplasmic reticulum (ERAD), less is known about how misfolded proteins in the cytosol are recognized and degraded. The cytosolic fatty acid synthase complex (FAS) of Saccharomyces cerevisiae, which is composed of six Fas1- and six Fas2-subunits, is rather stable to proteolysis in vivo. In the absence of the Fas1 subunit (FAS1 deletion strain) the remaining Fas2 subunit becomes an orphan protein which is proteolytically unstable and is targeted to the 26S proteasome for degradation (Egner et al, 1993). In my work, I used the orphan Fas2 protein as object of investigation in order to identify new cellular components that are involved in the recognition and degradation of a natural unassembled protein subunit in S. cerevisiae. In addition, it was elucidated how these newly identified factors act in the quality control process of a naturally occurring orphan protein. Due to previous reports (Heck et al, 2010; Prasad et al, 2010) showing that some cytosolic misfolded proteins are imported into the nucleus for proteasomal degradation the cellular localization of orphan Fas2 was determined. Using laser-scanning microscopy it could be shown that C-terminally EGFP-tagged (enhanced green fluorescent protein) orphan Fas2 is localized to the cytosol, thus representing a potential substrate for the cytosolic quality control system (CytoQC). Furthermore, glycerol step density gradient centrifugation experiments revealed that the majority of the orphan Fas2 proteins are organized in high molecular assembly intermediates, which consist mostly of Fas2 homohexamers. By using the thermosensitive ssa1-45 mutant carrying in addition the gene deletions of SSA2, SSA3 and SSA4, it could be shown that the proteasomal degradation of the orphan protein is dependent on the Hsp70 chaperone Ssa1. It is likely that Ssa1 is required for keeping orphan Fas2 soluble. All members of the Hsp90-, Hsp100-, and Hsp110-chaperone family as well as the small heat shock proteins Hsp26 and Hsp42 were shown to have no effect on the degradation of orphan Fas2. Selected members of the Hsp40 chaperone family, including Apj1, Xdj1 and even Ydj1 also did not show a significant influence on the Ssa1-dependent elimination of the substrate. To prove whether other components of the UPS than the proteasome are required for degradation of orphan Fas2 different E2- and E3 gene deletion mutants were analyzed. It was found that the elimination of orphan Fas2 is strongly delayed in a strain carrying a UBC2 UBC4 double deletion. As single deletions of UBC2 and UBC4 have no significant effect on the turnover of the substrate, it can be assumed that these E2 enzymes have complementing functions in the degradation process of orphan Fas2. In a search for the responsible E3 ubiquitin ligase(s) required for orphan Fas2 degradation the E3 RING ligase Ubr1 was identified. Deletion of UBR1 leads to a strongly delayed degradation of orphan Fas2. The expression of an Ubr1 RING mutant (C1220S) or of an Ubr1 type-1 N-end rule mutant (D176) from a high-copy plasmid in the UBR1 deletion strain cannot complement the strongly delayed degradation of orphan Fas2. In contrast, the stabilization of the orphan protein in the UBR1 deletion strain is reversed, when the same strain harbours a high-copy plasmid expressing wild type Ubr1 or an Ubr1 type-2 N-end rule mutant (P406S) or even a cytosolically-located version of the nuclear E3 RING ligase San1 due to deletion of the nuclear localization sequence. Interaction studies revealed that the E3 RING ligase Ubr1 is physically associated with orphan Fas2. In addition, it was found that Ubr1 mutants harbouring either a defect RING domain or a defect in one of the N-end rule substrate-binding sites (type-1 or type-2) were still able to physically interact with orphan Fas2. Further studies showed that the physical association of orphan Fas2 and Ubr1 remains stable in the conditional ssa1-45 mutant carrying in addition deletions of SSA2 to SSA4. This indicates that already E3-bound orphan Fas2 may not require a functional peptide-binding domain of Ssa1 to maintain the physical contact to Ubr1. Finally, the AAA-ATPase Cdc48 was identified to be necessary for the elimination process of orphan Fas2. Cdc48 may function in the dissociation process of orphan Fas2 assembly intermediates, which mainly consist of Fas2-homohexamers.