04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik
Permanent URI for this collectionhttps://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/5
Browse
26 results
Search Results
Item Open Access Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenasen und Prozessentwicklung der enzymatischen Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol(2008) Samorski, Markus; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)Für die enzymatische Dehalogenierung von 1,2,3-Trichlorpropan zu optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol wurden im Rahmen dieser Arbeit die kovalente Immobilisierung mit dem Enzymträger Eupergit modelliert, die enzymkinetische Charakterisierung der eingesetzten Haloalkan-Dehalogenasen durchgeführt, ein detailliertes Festbettreaktormodell erarbeitet, eine vollautomatisierte Versuchsanlage zur Modellvalidierung und Prozessoptimierung entworfen, gebaut und betrieben, das Langzeitaktivitätsverhalten der beiden Haloalkan-Dehalogenasen untersucht sowie eine Bewertung der eingesetzten Immobilisierungsmethoden vorgenommen. Die Eupergit-Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenase DhaA wurde durch ein kinetisches Modell beschrieben, das aufgrund der Abwesenheit diffusiver Limitierungen die Phänomene Inaktivierung des löslichen Enzyms und Immobilisierungsreaktion in einphasiger Weise beschreibt und einer analytischen Lösung zugänglich ist. Die experimentelle Überprüfung offenbarte eine ausreichende Vorhersagegüte des Modells. Aufgrund der stärkeren thermischen Aktivierung der Immobilisierungsreaktion gegenüber der Enzyminaktivierung führt eine Absenkung der Immobilisierungstemperatur zu sowohl geringeren Enzym-Ausbeuten als auch niedrigeren Raum-Zeit-Ausbeuten der Immobilisierung. Die Ausbeute an aktiv immobilisiertem Enzym kann durch den Einsatz hoher Eupergit-Konzentrationen gesteigert werden. Der Einfluss der Eupergit-Konzentrationen bei der Immobilisierung auf die Reaktorgröße des Syntheseprozesses konnte quantifiziert werden. Die enzymkinetische Beschreibung der Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4, die durch eine Michaelis-Menten-Kinetik mit kompetitiver Produktinhibierung sowohl temperatur- als auch pH-abhängig vorgenommen wurde, konnte die unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften der Enzyme offen legen. Haloalkan-Dehalogenase DhaA zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Substrat und Produkt der betrachteten Dehalogenierung aus (K_M(30°C, pH 9) = 1,79 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 1,56 mmol/l), während das Enzym DSD4 sowohl eine geringere Substrat- als auch Produktaffinität aufweist (K_M(30°C, pH 9) = 9,96 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 25,6 mmol/l). Auf Basis der kinetischen Daten konnte ein Festbettreaktor als der ideale Reaktortyp für die enzymatische Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol identifiziert werden. Zur Beschreibung des Festbettreaktors wurde ein detailliertes Modell entwickelt, das zwei Kompartimente unterscheidet und die Phänomene Konvektion, Dispersion, Stofftransport, Diffusion, Adsorption und Reaktion berücksichtigt. Die benötigten Parameterwerte wurden teilweise experimentell bestimmt oder empirischen Korrelationen aus der wissenschaftlichen Literatur entnommen. Das zur Erzielung höherer Produktkonzentrationen erarbeitete Konzept eines Rückführungsprozesses wurde ebenfalls adäquat modelliert. Miniplant-Experimente der immobilisierten Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4 zeigten eine gute Übereinstimmung der experimentellen Beobachtungen und den Simulationsergebnissen. Die Konzentrationsprofile im Festbettreaktor von Fließgleichgewichtsexperimenten werden in erster Linie von den enzymkinetischen Parametern bestimmt, während das dynamische Reaktorverhalten nach einer sprunghaften Änderung der Zulaufbedingungen erheblich von der Substrat- und Produktadsorption am Enzymträger abhängt. Bei den experimentellen Beobachtungen der Prozessvariante mit Rückführung wurde eine Nebenproduktbildung beobachtet, die die Prozessbeschreibung durch das Modell aufgrund zusätzlich verbrauchter Lauge erschwert. Im Falle geringer Nebenproduktbildung kann die Abweichung toleriert und die Vorhersage der zeitlichen Konzentrationsverläufe durch das Modell als ausreichend bezeichnet werden. Die erzielte Raum-Zeit-Ausbeute des Prozesses mit Rückführung entspricht in etwa der des kontinuierlich betriebenen Festbettreaktors bei gleichem Umsatz.Item Open Access Modellgestützte Entwicklung eines mehrstufigen Verfahrens zur enzymatischen Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren(2008) Teves, Harald; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vollständigen Verfahrens zur Synthese von enantiomerenreinen L-Aminosäuren durch Biotransformation mit immobilisierten Enzymen. Als Modellsystem wurde die zweistufige Hydrolyse von D,L-Benzylhydantoin über L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin gewählt. Die erste Stufe wurde durch das enantioselektive Enzym Hydantoinase katalysiert und die zweite durch das enantiospezifische Enzym L-Carbamoylase. Ein Schwerpunkt war die Analyse und Modellierung des gegebenen Reaktionssystems, das die reversible Reaktion von D- bzw. L-Benzylhydantoin zu D- und L-Caramoylphenylalanin, die irreversible Reaktion von L-Carbamoylphenylalanin zu L-Phenylalanin sowie die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin umfasste. Die Parameter in den enzymkinetischen Gleichungen wurden aus Anfangsreaktionsraten und zeitlichen Konzentrationsverläufen abgeschätzt. Da in einer Versuchsanlage an poröse Partikel immobilisierte Enzyme Verwendung fanden, wurden die enzymkinetischen Modelle um Gleichungen für den externen Transport der Reaktanten an die Partikeloberfläche und den internen Transport in den Partikeln erweitert. Die Racemisierung des Substrats Benzylhydantoin wurde mit zwei Modellen beschrieben, die sich in ihrem Detaillierungsgrad unterschieden. Während das erste Modell die Dissoziation des Benzylhydantoins berücksichtigte und die basenkatalysierte Racemisierung in wässriger Lösung von der Racemisierung an einem Ionenaustauscher differenzierte, vereinigte das zweite Modell die verschiedenen Mechanismen zu einer reversiblen Reaktion mit Hin- und Rückreaktion jeweils pseudo-erster Ordnung. Wichtigstes Ergebnis des detaillierten Modells war die Beschleunigung der Racemisierung durch Verschiebung des pH-Werts, wobei der durch Katalyse am Ionenaustauscher erzielte Geschwindigkeitszuwachs im Vergleich zur spontanen Reaktion exponentiell anstieg. Auf der reaktionstechnischen Analyse bauten die Gestaltung einer Versuchsanlage im Labormaßstab und die Erstellung eines mathematischen Prozessmodells dieser Versuchsanlage auf. Mit Rücksicht auf die begrenzte Aktivität der Enzymimmobilisate und die geringe Löslichkeit des Benzylhydantoins wurde das Verfahren, welches drei Operationen umfasste, absatzweise betrieben: Auflösung von D,L-Benzylhydantoin in einem gerührten Membranreaktor, zweistufige enzymatische L-Phenylalanin Synthese in einem Festbettreaktor mit immobilisierter Hydantoinase und L-Carbamoylase sowie Racemisierung des nicht abreagierten Substrats D-Benzylhydantoin in einem zweiten mit starkem Anionenaustauscher gefüllten Festbettreaktor. Alle drei Apparate waren hintereinandergeschaltet und bildeten einen geschlossenen Kreislauf. Optional erfolgte eine nachgeschaltete Aufreinigung des Produkts L-Phenylalanin durch Elektrodialyse. Im Vorfeld zu den experimentellen Arbeiten an der Versuchsanlage - und später auch diese begleitend - wurde ein mathematisches Modell des gesamten Verfahrens erstellt und mit Versuchsdaten parametriert. Dieses Modell bildete die Auflösung von festem Benzylhydantoin in einem ideal durchmischten Membranreaktor, die enzymatische Umsetzung im ersten und anschließende Racemisierung im zweiten Festbettreaktor sowie die Rückführung in den Membranreaktor ab. Bezüglich der Festbettreaktoren wurden die Stoffbilanzen getrennt für das Hohlraumvolumen sowie die porösen Partikel der Schüttung aufgestellt. Verkoppelt waren sie durch den Stoffübergang an der Oberfläche eines jeden Partikels. In den porösen Partikeln katalysierten die an der inneren Oberfläche immobilisierten Enzyme die im vorangehenden beschriebenen Reaktionen. Es resultierten hauptsächlich partielle Differentialgleichungen, die mit einem finite Volumen Verfahren (TVD) örtlich diskretisiert und dem numerischen Integrator LIMEX gelöst wurden. Da die vollständige Umsetzung des racemischen Substrats D,L-Benzylhydantoin zum enantiomerenreinen Produkt L-Phenylalanin wesentlich von der Racemisierung abhing, kam dieser Umlagerungsreaktion eine zentrale Bedeutung zu. Es zeigte sich, dass eine Steigerung der Produktausbeute eine überproportionale Erhöhung der Ionenaustauschermasse erforderte. Andererseits bedeutete die Erhöhung der Ionenaustauschermasse einen zunehmenden Verlust an Produkt, da es durch Bindung an den Ionenaustauscher in der Reaktionslösung abgereichert wurde. Bezüglich des theoretisch möglichen Enantiomerenüberschusses von 100 % bei vollständiger Umsetzung des racemischen Substrats erwies sich beim gegebenen pH-Wert auch mit maximaler Racemisierungsgeschwindigkeit die langsame Rückreaktion von D-Carbamoylphenylalanin zu D-Benzylhydantoin als limitierend, und es resultierte ein maximaler Enantiomerenüberschuss von 64 %. Simulationsergebnisse belegten den vernachlässigbaren Einfluss der Auflösungskinetik des Benzylhydantoins auf das Gesamtgeschehen.Item Open Access Optimizing mass transfer in multiphase fermentation : the role of drag models and physical conditions(2023) Mast, Yannic; Wild, Moritz; Takors, RalfDetailed knowledge of the flow characteristics, bubble movement, and mass transfer is a prerequisite for the proper design of multiphase bioreactors. Often, mechanistic spatiotemporal models and computational fluid dynamics, which intrinsically require computationally demanding analysis of local interfacial forces, are applied. Typically, such approaches use volumetric mass-transfer coefficient (kLa) models, which have demonstrated their predictive power in water systems. However, are the related results transferrable to multiphase fermentations with different physicochemical properties? This is crucial for the proper design of biotechnological processes. Accordingly, this study investigated a given set of mass transfer data to characterize the fermentation conditions. To prevent time-consuming simulations, computational efforts were reduced using a force balance stationary 0-dimension model. Therefore, a competing set of drag models covering different mechanistic assumptions could be evaluated. The simplified approach of disregarding fluid movement provided reliable results and outlined the need to identify the liquid diffusion coefficients in fermentation media. To predict the rising bubble velocities uB, the models considering the Morton number (Mo) showed superiority. The mass transfer coefficient kL was best described using the well-known Higbie approach. Taken together, the gas hold-up, specific surface area, and integral mass transfer could be accurately predicted.Item Open Access Resolving heterogeneities in single and multiphase bioreactor systems - Predictive modelling tools towards successful scale-up(2020) Kuschel, Maike; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Deciphering population dynamics as a key for process optimization(2016) Lieder, Sarah; Takors, Ralf (Prof. Dr.)Item Open Access Getting the right clones in an automated manner : an alternative to sophisticated colony-picking robotics(2024) Hägele, Lorena; Pfleger, Brian F.; Takors, RalfIn recent years, the design-build-test-learn (DBTL) cycle has become a key concept in strain engineering. Modern biofoundries enable automated DBTL cycling using robotic devices. However, both highly automated facilities and semi-automated facilities encounter bottlenecks in clone selection and screening. While fully automated biofoundries can take advantage of expensive commercially available colony pickers, semi-automated facilities have to fall back on affordable alternatives. Therefore, our clone selection method is particularly well-suited for academic settings, requiring only the basic infrastructure of a biofoundry. The automated liquid clone selection (ALCS) method represents a straightforward approach for clone selection. Similar to sophisticated colony-picking robots, the ALCS approach aims to achieve high selectivity. Investigating the time analogue of five generations, the model-based set-up reached a selectivity of 98 ± 0.2% for correctly transformed cells. Moreover, the method is robust to variations in cell numbers at the start of ALCS. Beside Escherichia coli , promising chassis organisms, such as Pseudomonas putida and Corynebacterium glutamicum , were successfully applied. In all cases, ALCS enables the immediate use of the selected strains in follow-up applications. In essence, our ALCS approach provides a ‘low-tech’ method to be implemented in biofoundry settings without requiring additional devices.Item Open Access Isotopisch-instationäre 13 C-Stoffflussanalyse in Escherichia coli(2007) Schaub, Jochen; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)Die 13C-Stoffflussanalyse ist ein wichtiges Werkzeug im Metabolic Engineering. Ausgangs-punkt dieser Arbeit war der Umstand, dass eine breitere Anwendung der 13C-Stofffluss-analyse, z. B. bei der Analyse der industriell relevanten Prozessführungen Batch und Fed Batch sowie bei tierischen Zellkulturen, bisher insbesondere wegen der eingesetzten GC-MS und NMR basierten Analyse proteinogener Aminosäuren beschränkt ist. Aufgrund der großen Zeitkonstanten infolge eines kleinen Protein-Turnover wird ein quasi-stationärer Zustand in einem für die Stoffflussanalyse interessanten Zeitbereich nicht erreicht. Daher wird diese Vorgehensweise vor allem bei der kontinuierlichen Prozessführung verwendet. Alternativ müssen aufwändige Reaktorkonzepte eingesetzt werden (Drysch et al., 2004). Außerdem bedeutet die erforderliche lange Markierungsdauer hohe experimentelle Kosten. Mittels LC-MS Analysemethoden ist es seit kurzem möglich, intrazelluläre Markierungs-informationen auch direkt auf der Ebene der Metabolite des zentralen Kohlenstoffwechsels zu erheben (van Winden et al., 2005). Wegen des großen Metabolit-Turnover kann auf diese Weise die Zeitdauer eines Markierungsexperimentes erheblich reduziert und damit das Anwendungsspektrum der 13C-Stoffflussanalyse erweitert werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erstmals Messinformationen aus der isotopisch instatio-nären Markierungsdynamik zur Identifikation der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli genutzt werden. Dafür werden Messinformationen zu Absolutkonzentrationen und relativen Massenisotopomerenanteilen benötigt. Für diesen Ansatz der isotopisch instationären 13C-Stoffflussanalyse wurden experimentelle, analytische und rechnergestützte Verfahren entwickelt und eingesetzt. Die Durchführung von Kurzzeit-13C-Markierungsexperimenten erfordert schnelle Probe-nahmetechniken. Hierfür wurde ein neuartiges, auf die LC-MS Analytik abgestimmtes integriertes Probenahmeverfahren entwickelt. Da die Grundoperationen Probentransfer, Abstoppen des Metabolismus, Metabolitextraktion und Probenaufarbeitung indirekt in einem Kapillar-Rohrwendel-Wärmeübertrager ohne jeden Zusatz chemischer Reagenzien erfolgten, konnte die Anzahl der Grundoperationen verringert und durch Automatisierung die Repro-duzierbarkeit verbessert werden. Der Zeitbedarf zur Durchführung dieser Schritte wurde auf 30 s je Probe reduziert. Des Weiteren wurde eine LC-MS Analysemethode für die Quanti-fizierung von intrazellulären Absolutkonzentrationen und von Massenisotopomeren im iso-topisch stationären und isotopisch instationären Zustand entwickelt. Zur Validierung und Ergänzung der LC-MS basierten Bestimmung von Massenisotopomeren wurden GC-MS basierte Messungen freier und proteinogener Aminosäuren durchgeführt. Neben einer geeigneten schnellen Probenahmetechnik und einer LC-MS Analysemethode werden für die isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse auch neue Ansätze in der Simulation von 13C-Markierungsexperimenten und für die Flussschätzung benötigt. Hierfür wurden die Bilanz-gleichungen des Isotopomerenmodells des untersuchten Reaktionsnetzwerkes automatisiert generiert und das resultierende nichtlineare, gekoppelte und steife Isotopomeren-Differentialgleichungssystem numerisch integriert. Als besonders geeignet für eine numerisch stabile Integration erwies sich der Extrapolationsintegrator LIMEX. Dieser kann außerdem isotopisch instationäre Messdatensätze für die nachfolgende Flussschätzung berücksichtigen. Für die Optimierung wurde der Evolutionsalgorithmus JavaEvA verwendet. Die entwickelten experimentellen, analytischen und rechnergestützten Verfahren wurden für die Ermittlung der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli W3110 bei D = 0.1 h-1 ange-wendet. Zunächst wurde dieser Stamm physiologisch charakterisiert. In einem nächsten Schritt wurden intrazelluläre Metabolitkonzentrationen im steady state und nach einem stimulus-response Experiment mittels LC-MS quantitativ bestimmt. Ebenfalls mit LC-MS wurden isotopisch stationäre und isotopisch instationäre Massenisotopomerenverteilungen von Metaboliten des zentralen Kohlenstoffwechsels quantifiziert. Die Bestimmung der Markierungsmuster freier und proteinogener Aminosäuren erfolgte mit GC-MS. Die LC-MS und GC-MS Datensätze wurden im Folgenden zur Durchführung von isotopisch instationären und isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen in E. coli verwendet. Die LC-MS basierte isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse wurde erfolgreich zur Ermittlung der intra-zellulären Stoffflussverteilung in den zentralen Kohlenstoffwechselwegen Glykolyse, Pentosephosphat-Weg und Tricarbonsäure-Zyklus eingesetzt. Als wesentliche Ergebnisse wurden eine Flussverteilung (bezogen auf die Glucoseaufnahmerate) am G6P-Knoten zwischen Glykolyse und Pentosephosphat-Weg von 55% : 44% sowie mit 4% nur eine geringe Aktivität des Malatenzyms bestimmt. Diese Resultate waren in guter Überein-stimmung mit den gleichfalls durchgeführten LC-MS und GC-MS basierten isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen sowie Literaturwerten. Insgesamt ist die Anwendung der entwickelten Methodik bestehend aus integriertem Probe-nahmesystem, LC-MS Analysemethode und isotopisch instationärer 13C-Stoffflussanalyse aussichtsreich für die Bearbeitung von Fragestellungen im Metabolic Engineering, in der Bio-prozessanalyse und -entwicklung, im Hochdurchsatzscreening und für systembiologische Untersuchungen. Dieses erweiterte Spektrum potentieller Anwendungen wird maßgeblich durch die Nutzung der kleinen Zeitkonstanten beim Metabolit-Turnover ermöglicht.Item Open Access Metabolic egineering of the valine pathway in corynebacterium glutamicum : analysis and modelling(2007) Magnus, Jørgen Barsett; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing)The functionality of the intracellular reaction network in a Corynebacterium glutamicum valine production strain was investigated with special focus on the valine / leucine biosynthesis pathway. The aim was to gain a quantitative understanding of the behaviour of the reaction network. The methods required to do so were developed, and enzyme targets for the further optimisation of the investigated strain were identified. The intracellular metabolite concentrations were observed during a transient state by performing a glucose stimulus experiment. A mathematical model describing the in vivo reaction dynamics of the valine / leucine pathway was developed and a metabolic control analysis was performed based on the data from the stimulus experiment and the dynamic model. The thermodynamic driving forces in the valine / leucine pathway were analysed. The optimal procedure for the stimulus experiment with respect to obtaining a useful data set for the modelling and analysis was identified. Samples were taken at sub-second intervals and the concentrations of 26 metabolites from the valine / leucine pathway and the central metabolism were measured. A very fast response to the stimulus was observed in most intracellular metabolites with for example a 3-fold increase in the pyruvate concentration within one second. The connectivities of the metabolites around the ketoisovalerate branchpoint were investigated using a time series analysis. The kinetic model consisted of a system of differential equations defined by setting up material balances on the metabolites. The model can simulate the concentrations and fluxes in the valine and leucine pathway accurately during the transient state. The implementation of a model selection criterion based on the second law of thermodynamics was demonstrated to be essential for the identification of realistic and unique models. Other, alternative methods of setting up a kinetic model were also investigated. The alternative models included a mechanistic model of the valine / leucine pathway and a large linlog model of the whole metabolism of the strain. The mechanistic model was not capable of simulating the measured concentrations due to the limitations of its elasticities. The instability of the whole cell model made it inappropriate for a metabolic control analysis and further interpretation. However, the simulation of the whole metabolism of the strain provides a proof of concept for the whole cell modelling approach and shows in which direction metabolic modelling will develop in the future. Both data driven and model based methods were used to analyse the control hierarchy in the valine / leucine pathway. In addition, predictions of the effect of changes in the enzyme levels were made based on the model. In an optimisation study the enzyme levels were optimised with respect to the valine flux. Based on the acquired understanding of the behaviour of the reaction network the following targets for further strain development were identified: 1. Overexpression of the valine translocase 2. Implementation of an inhibition resistant AHAS enzyme and possibly further overexpression. 3. Removal of the overexpression of the gene coding for DHAD on the plasmid to save the cell the burden of overproducing this enzyme which has negligible influence on the valine flux. 4. Modification of the central carbon metabolism to increase pyruvate availability. The identification of the targets for strain development demonstrates the usefulness of a kinetic model in metabolic engineering and in the general understanding of metabolic control. The concentration data and the kinetic model were used to analyse the thermodynamic driving force, i.e. the reaction affinity, in the valine / leucine pathway. The concept of a reaction resistance was introduced to relate the driving force to reaction rate in analogy with Ohm’s law. This provided a new angle of analysing metabolic networks. The linear relation between reaction rate and affinity which apply for uni-uni reactions can not be assumed to be valid for bi-bi reactions operating far from equilibrium. The theory of metabolic control analysis was extended to include also the reaction potential and the reaction resistance. Reactions far from equilibrium are controlled almost entirely through the changes in the resistance while reactions closer to equilibrium are also affected by changes in the affinity.Item Open Access Modeling in vitro and in vivo transcription and translation with different levels of granularity(2018) Nieß, Alexander; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Identification of key regulatory interactions governing the growth rate in Corynebacterium glutamicum(2024) Haas, Thorsten; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)The dissertation identifies key regulatory mechanisms governing the growth rate of Corynebacterium glutamicum.
- «
- 1 (current)
- 2
- 3
- »